具有过氧合酶活性的多肽制造技术

本发明专利技术涉及具有过氧合酶活性的分离的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明专利技术还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。编码过氧合酶的多核苷酸分离自黄褐毁丝霉。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】具有过氧合酶活性的多化 对序列表的引用 本申请包括一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。[000引背景 专利
本专利技术设及具有过氧合酶（peroxygenase)活性的多肤和编码该些多肤的多核巧 酸。本专利技术还设及核酸构建体、载体W及包括该些多核巧酸的宿主细胞连同产生和使用该 些多肤的方法。 相关技术说明 W0 2006/034702A1披露了使用茶树茹TMA1的AaP过氧合酶来酶促哲基化未活 化的姪（例如，蒙、甲苯和环己烧）的方法。该也描述于乌尔里克扣llrich)和霍夫里克特 (Hofrichter)，2005,欧洲生化学会联合会快报（阳BSLetters) 579:6247-6250 中。 DE10332065A1披露了用于通过使用茶树茹TMA1的AaP过氧合酶通过醒的中间 形成从醇中酶法制备酸的方法。[000引报道了用于通过该AaP过氧合酶而快速和选择性地W分光光度计直接检测芳香 族哲基化的方法（克卢格化luge)等人，2007,应用微生物学和生物技术（ApplMicrobiol Biotechnol)75:1473-1478)0 从嗜粪真菌福毛鬼伞（Coprinusradians)中分离了另一种能够进行芳香族过氧 合化（peroxygenation)的过氧合酶并对其进行了表征，鉴定了N-末端16个氨基酸并与较 早公布的茶树茹的AaP酶的N-末端14个氨基酸进行了比对；但是未分离编码基因（安赫 (Anh)等人，2007,应用与环境微生物学（ApplEnvMicrobiol) 73 (17): 5477-5485)。 WO2008/119780披露了若干种不同的过氧合酶多肤及其编码多核巧酸连同其重 组产生。wo2011/120938披露了使用过氧合酶多肤的脂肪姪的位点特异性哲基化。 本专利技术提供了具有过氧合酶活性的新颖多肤和编码该些多肤的多核巧酸。[001引专利技术概述 本专利技术设及具有过氧合酶活性的分离的多肤，该些分离的多肤选自下组，该组由 W下各项组成：(a) -种多肤，该多肤与SEQIDNO:2的成熟多肤具有至少60%的序列一致性； 化）一种由W下多核巧酸编码的多肤，该多核巧酸在中严谨度条件下与（i)SEQID NO: 1的成熟多肤编码序列、（ii)其cDNA序列、或（iii) (i)或（ii)的全长互补体杂交； (C) 一种由W下多核巧酸编码的多肤，该多核巧酸与SEQIDN0:1的成熟多肤编码 序列、或其cDNA序列具有至少60%序列一致性； (d)SEQIDN0:2的成熟多肤的一种变体，该变体在一个或多个（例如，若干个）位 置处包括取代、缺失、和/或插入；W及(e) (a)、化）、（C)或（d)的多肤的一个片段，该片段具有过氧合酶活性。 本专利技术还设及编码本专利技术的多肤的分离的多核巧酸；核酸构建体；重组表达载 体；包括该些多核巧酸的重组宿主细胞；W及产生该些多肤的方法。 本专利技术还设及使用本专利技术的多肤的方法。 本专利技术还设及一种编码信号肤的多核巧酸，该信号肤包括SEQIDNO:2的氨基 酸-17至-1或由其组成，该多核巧酸被可操作地连接至编码一种蛋白质的基因；包括该些 多核巧酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞；W及产生一种蛋白质的方法。[002引定义 过氧合酶（Peroxygenase):术语"过氧合酶"意指根据EC1. 11. 2. 1的一种"非特 异性过氧合酶"活性，其催化来自馬化的一个氧原子插入多种底物（例如硝基苯并二曠茂） 中。出于本专利技术的目的，过氧合酶活性是根据描述于实例2,或描述于W下中的程序确定的： M.波拉杰-可比尔斯考（Poraj-Kobielska)，M.金巧化inne)，R.乌尔里克扣llrich)，K.诗 切布内尔（Scheibner)，M.霍夫里克特化0化ichter)，"用于检测真菌过氧合酶的分光光度 计测定（Aspectrophotometricassayforthedetectionoffungalperoxygenases) "， 分析生物化学（Anal5rticalBiochemistir) (2012)，第 421 卷，第 1 期，第 327 - 329 页。 在一个方面中，本专利技术的该些多肤（过氧合酶）具有SEQIDN0:2的成熟多肤的至 少20%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95% 或至少100%的过氧合酶活性。 等位基因变体；术语"等位基因变体"意指占据同一染色体基因座的基因的两种或 更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可W导致群体内的多 态性。基因突变可W是沉默的（在所编码的多肤中没有改变）或可编码具有改变的氨基酸 序列的多肤。多肤的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肤。 cDNA;术语"cDNA"意指可W通过反转录从得自真核或原核细胞的成熟的、已剪接 的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺乏可W存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早 先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步 骤进行加工，包括剪接。[002引编码序列；术语"编码序列"意指直接指定一个多肤的氨基酸序列的多核巧酸。编 码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子（如ATG、 GTG或TTG)开始并且W-个终止密码子（如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可W是一种 基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。 控制序列；术语"控制序列"意指对于表达编码本专利技术的成熟多肤的多核巧酸所必 需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肤的多核巧酸来说可W是天然的（即，来自相 同基因）或外源的（即，来自不同基因），或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列 包括但不限于前导子、聚腺巧酸化序列、前肤序列、启动子、信号肤序列、W及转录终止子。 至少，控制序列包括启动子，W及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将该些控制序列与 编码一种多肤的多核巧酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，该些控制序列可W 提供有多个接头。 表达；术语"表达"包括设及多肤产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修 饰、翻译、翻译后修饰、W及分泌。 表达载体；术语"表达载体"意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码多肤的多 核巧酸并且该多核巧酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。 片段；术语"片段"意指具有从成熟多肤或结构域的氨基和/或駿基末端缺失的一 个或多个（例如，若干个）氨基酸的多肤或催化结构域；其中该片段具有过氧合酶活性。在 一个方面中，一个片段包含至少240个氨基酸残基（例如，SEQIDNO:2的氨基酸1至240 或SEQIDNO:2的氨基酸20至240)、至少230个氨基酸残基（例如，SEQIDNO:2的氨基 酸1至230或SEQIDNO: 2的氨基酸20至230)或至少220个氨基酸残基（例如，SEQID NO:2的氨基酸1至220或SEQIDNO:2的氨基酸20至220)。 高严谨度条件：术语"高严谨度条件"意指对于长度为至少100个核巧酸的探针而 言，遵循标准DNA印迹程序，在42°C下在5XSS阳、0. 3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有过氧合酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；(b)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在中严谨度条件、中‑高严谨度条件、高严谨度条件、或非常高严谨度条件下与以下各项杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列、(ii)其cDNA序列、或(iii)(i)或(ii)的全长互补体；(c)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的一种变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失、和/或插入；以及(e)(a)、(b)、(c)或(d)的多肽的一个片段，该片段具有过氧合酶活性。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·兰德维克，L·H·厄斯特高，L·卡卢，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK