一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因及其编码蛋白和应用，它涉及一种PuGGPS蛋白及其编码基因在紫菜类胡萝卜素和叶绿素代谢中的应用。本发明专利技术的基因的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示或与序列表SEQ ID NO:1核苷酸序列具有80%以上同源性且编码相同功能蛋白质的多核苷酸序列。它的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示或由序列表Seq ID No：2所述的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与序列表Seq ID No：2所述的氨基酸残基序列相同活性的氨基酸序列。它用于紫菜类胡萝卜素代谢基因工程中。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种脐形紫菜牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶PuGGPS蛋白及其编码基因在紫菜类胡萝卜素和叶绿素代谢中的应用。
技术介绍
紫菜是一种重要的大型经济海藻，是中国、日本和韩国主要的栽培红藻之一。全世界的紫菜栽培产业年产值约13亿美元(Blouin et al. 2011)。紫菜不仅具有重要的经济价值，而且是研究植物生理、生化以及早期进化的理想材料(Waaland et al. 2004; Lin et al. 2009; Su et al. 2010)。紫菜生长在潮间带，必须耐受周期性的极端逆境(如高光、高盐、失水等)，长期的进化过程使其产生了在逆境下对光合系统的保护机制。类胡萝卜素在高等植物中起着吸收光能和光保护双重作用。高等植物中类胡萝卜素通常整合在捕光色素复合物或者光系统的反应中心，不仅在结构上起着稳定光系统的作用 (Dall'Osto et al. 2006)，辅助叶绿素吸收光能，并且可以通过叶黄素循环机制将吸收的多余光能以热能的形式放散到空气中从而保护光系统不受光氧化损伤(Niyogi 1999; 唐婷等 2012) (Ruban et al. 2007)。虽然研究表明，红藻大多数物种都不具有叶黄素循环所需要的花药黄素和堇菜黄素(Schuber et al. 2006)，但有工作表明，红藻等以藻胆体进行光合作用的原始藻类中，仍然主要通过类胡萝卜素结合的蛋白与藻胆体核心相互作用淬灭多余光能来保护光合系统(Kirilovsky, 2007; Rakhimberdieva et al., 2007)。不仅如此，类胡萝卜素在植物体内通常积累在花、果实和根部，鲜艳的颜色可以吸引昆虫或动物作为传粉或者散播种子的媒介。此外，类胡萝卜素作为维生素A的前体，对人类和动物有很大的营养价值（Cuningham and Gantt 1998； Shumskaya and Wurtzel 2013）。而类胡萝卜素中的叶黄素和玉米黄素存在于人类和动物眼中的黄斑区域，对人类视觉感受光线变化有十分重要的作用（Handelman et al. 1998）。牻牛儿基牻牛儿基二磷酸（GGPP）是由牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶（GGPS）催化产生的，是植物中十分重要的代谢中间产物，是类胡萝卜素、叶绿素、维生素E（生育酚）、维生素A、赤霉素、脱落酸、牻牛儿基牻牛儿基化蛋白等重要的生理生化物质合成代谢的前体物（Okada et al. 2000），并且可通过萜类合酶合成各种单萜、倍半萜和二萜等生理活性物质。对于可食用的植物如紫菜来说，可挥发的萜类物质可影响其口感和风味（伊纪峰等2009）。研究表明，拟南芥中GGPS是由小基因家族编码，共有12个，Okada et al.（2000）的研究表明只有GGPS11和GGPS7定位于质体中，并负责类胡萝卜素和叶绿素的合成代谢。有工作表明，不同的GGPS在植物中可能负责不同的GGPP代谢库。然而，在已形成沿海经济支柱产业的紫菜物种中，尚未有任何关于GGPS的报道。对以脐形紫菜为代表的紫菜物种中GGPS的发现和功能鉴定有利于未来利用基因工程技术提高紫菜中类胡萝卜素等营养成分的含量来提高紫菜的营养价值，并且通过提高萜类物质的含量改善紫菜的口感和风味，从而整体上提高紫菜的经济价值。
技术实现思路
本专利技术提供了一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因及其编码蛋白和应用，该基因转录组编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶，从而使紫菜中能够合成并积累类胡萝卜素。本专利技术的一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因，它的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示。本专利技术的一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因，它的核苷酸序列为与序列表SEQ ID NO:1核苷酸序列具有80%以上同源性且编码相同功能蛋白质的多核苷酸序列。本专利技术的一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因编码的蛋白，它的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。 本专利技术的一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因编码的蛋白，它的氨基酸序列为由序列表Seq ID No：2所述的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与序列表Seq ID No：2所述的氨基酸残基序列相同活性的氨基酸序列。本专利技术的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因来源于脐形紫菜（Porphyra umbilicalis），名称为PuGGPS，以下该基因简称为PuGGPS。 所述的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶来源脐形紫菜。 一种重组表达载体，它包括权利要求1或2所述的基因。一种转化子，它包括含有权利要求6所述的重组表达载体的宿主细胞。所述的一种转化子，它的宿主为微生物、植物或转基因细胞系。 本专利技术的一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因的应用，它用于紫菜类胡萝卜素代谢基因工程中。 本专利技术的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因（PuGGPS）获取方式为： 一、总RNA的提取选取脐形紫菜（Porphyra umbilicalis）（由缅因大学Susan Brawley教授赠予）采用RNAiso试剂(Takara公司)并用8 mol/L的 LiCl沉淀提取纯化脐形紫菜总RNA，经电泳检测和紫外分光光度计检测确认RNA的完整性、纯度以及浓度后，于-80 oC保存； 二、脐形紫菜牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶（PuGGPS）基因的克隆以不同生物中的牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶作为查询序列，在脐形紫菜转录组数据库中搜索到一条可能编码牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶的转录本（P_umbilicalis_esContig5139）。根据该转录本，设计引物，扩增PuGGPS ORF全长：3'- PCR引物：TCAGTTCCTTCGCTCAAATGATGAAG5'- PCR引物：ATGCTCCGCACCGAGCCC用1 μg步骤一获得的总RNA作为反转录的模板，经反转录合成cDNA第一链后，进行PCR扩增，PCR反应体系中加入终浓度为5%的DMSO，PCR程序如下：98℃预变性15 sec；98℃变性10 sec，64℃退火10 sec，72℃延伸2 min，35个循环后，72℃ 5 min。将PCR产物连接至pMD19-T（Takara公司）载体，测序后获得具有完整编码区的脐形紫菜牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因PuGGPS的ORF序列 Seq ID No：1。 三、大肠杆菌表达载体的构建用带有Sac I和Hind III酶切位点的引物扩增PuGGPS完整编码区或者截除信号肽后部分序列克隆至pET-32b载体。带有Sac I和Hind III酶切位点的引物序列如下：上游引物：GTACGAGCTCCATGCTCCGCACCGAGC 或：GTACGAGCTCCACCCAAAAAGACAGCGTGG下游引物：CCCAAGCTTGGGTCAGTTCCTTCGCTCA四、酶活鉴定将步骤三获得的表本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因，其特征在于它的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因，其特征在于它的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示。
2.一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因，其特征在于它的核苷酸序列为与序列表SEQ ID NO:1核苷酸序列具有80%以上同源性且编码相同功能蛋白质的多核苷酸序列。
3.一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因编码的蛋白，其特征在于它的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。
4. 一种牻牛儿基牻牛儿基二磷酸合酶基因编码的蛋白，其特征在于它的氨基酸序列为由序列表Seq ID No：2所述的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与序列...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨立恩，陆勤勤，卢山，朱建一，黄惺祺，许广平，
申请(专利权)人：江苏省海洋水产研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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