一株根皮苷降解菌及其菌剂的制备和应用制造技术

本发明专利技术提供了一株根皮苷降解菌及其菌剂的制备和应用；根皮苷降解菌Enterobacter radicincitans G-19，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.9841；本发明专利技术分离得到的G-19菌株来源于山东省泰安市多年生苹果树根际土壤，经人工富集、驯化及纯化得到；该菌株对根皮苷具有较强的降解能力；能够在苹果树根际稳定定殖；利用该菌株制备的菌剂可有效防治因根皮苷积累造成的苹果连作障碍；菌剂的制备工艺简单、发酵周期短、成本低，利于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一株根皮苷降解菌及其菌剂的制备和应用
本专利技术提供一株根皮苷降解菌及其菌剂的制备和应用。属于农用微生物

技术介绍
苹果属于蔷薇科苹果属，是我国第一大水果品种，栽培面积约有200km2，栽培面积和产量均占世界的40％。苹果连作障碍是苹果产业面临的一大难题，连作苹果幼苗成活率低，根系发育不良，严重影响苹果产量和质量。对于连作障碍的发生机制，目前普遍认可的是由土壤肥力下降、微生物群落(尤其是根际微生物)结构失衡、化感作用等综合作用的结果。对于连作障碍的应对措施主要有增施肥料、选育抗病品种、与它种植物轮作、土壤消毒、施加微生物菌剂等。基于我国苹果栽培面积大、生产周期长、抗病品种选育困难、管理粗放等特点，在其他粮食、蔬菜等农作物上常用的轮作、改换品种、大量增施有机肥等措施，难以适应苹果连作障碍的克服。目前，越来越多的研究表明，自毒作用是连作障碍的主要原因之一。自毒作用是指某些植物可通过地上部淋溶、根系分泌和植株残茬腐解等途径，释放一些物质对同茬或下茬同种或同科植物生长产生抑制作用的现象。产生自毒作用的物质包括有机酸、直链醇、简单酚类、酚酸、单宁、醛类、萜类、氨基酸和生物碱等。根皮苷是苹果属特征性酚类化合物，研究表明根皮苷的浓度为0.001mmol/L时可促进幼苗的生长，但浓度达到1mmol/L时开始抑制幼苗的生长，降低干物质的积累，且随着处理浓度的增加，抑制作用加强。另外，根皮苷的降解产物根皮素、间苯三酚和肉桂酸等均能抑制果树生长。酚酸类化感物质主要通过以下方式维持自毒作用：(1)影响细胞膜的功能，抑制植物对养分的吸收，酚酸类化感物质对细胞膜的破坏可能是化感物质所产生的自毒效应的起点；(2)影响各种酶的功能和活性；(3)影响植物的光合、呼吸作用和根尖的生长。微生物可以影响自毒物质的数量和种类，对缓解自毒作用具有重要作用。某些微生物能够利用根皮苷等酚酸类自毒物质作为唯一碳源，减弱或消除自毒作用；某些有益微生物能够抑制土壤中病原菌的数量或干扰病原菌对寄主植物的侵染，改善植株根际的土壤生态环境，从而间接缓解自毒作用；植物根际的一些有益微生物通过产生的次级代谢产物，如植物激素和抗生素等，对作物有一定的促生和抗病作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株根皮苷降解菌及其菌剂的制备和应用；可应用于防治苹果的连作障碍。一株根皮苷降解菌G-19来源于泰安市多年生苹果树跟际土壤，经人工富集、驯化及纯化得到。该菌株已于2014年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。保藏号为CGMCCNO.9841，分类命名：促根生肠杆菌Enterobacterradicincitans。其16SrDNA序列如SEQ.NO.1所示。该菌株对根皮苷具有较强的降解能力；能够以根皮苷作为唯一碳源生长繁殖；能够在苹果树根际稳定定殖。利用根皮苷降解菌G-19生产的微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)菌种活化将保存的根皮苷降解菌G-19刮取一环划线接种于固体LB培养基上，28～32℃培养18～24h，挑取单菌落划线转接，培养12～18h。(2)种子液制备用接种环从LB固体培养基上刮取两环活化的根皮苷降解菌G-19，接入液体LB培养基,转速180～200r/m，温度28～32℃，摇瓶培养12～16h，得到G-19菌株种子液。(3)发酵培养将发酵培养基体积比1.0％～2.0％的G-19菌株种子液接种到发酵培养基中进行扩大培养；发酵温度28℃～32℃，转速180～200r/min，培养时间为24～28h，即得到G-19菌株的液体菌剂；所述发酵培养基的组分为：葡萄糖5g、黄豆饼粉20g、玉米粉40g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸铵0.5g、碳酸钙0.5g和水1L。使用时，每棵苹果树苗按照G-19菌株液体菌剂10～30mL中加入5～8L水的比例浇入其栽植穴；或先将G-19菌株液体菌剂10～30mL中加入2L水混合后浇入每棵苹果树苗栽植穴，再按常规浇水。本专利技术还提供了根皮苷降解菌G-19生产的微生物菌剂在防治苹果连作障碍中的应用，该菌剂可应用于防治由根皮苷积累引起的苹果连作障碍。本专利技术具有以下优点：1、本专利技术得到的根皮苷降解菌G-19具有较高的根皮苷降解能力，并能够在苹果根际稳定定殖。2、该菌菌剂的发酵工艺简单、发酵周期短，成本低，利于工业化生产。3、利用该菌株生产的菌剂可有效防治因根皮苷积累导致的苹果连作障碍。附图说明图1为根据16SrDNA序列利用Mega4.0分析构建的G-19菌株的系统进化树。由图1可以看出G-19菌株与肠杆菌属的遗传进化距离最近，与已知菌株Enterobacterradicincitans(AY563134)的16SrDNA同源性达到100％，结合该菌株的菌体形态、菌落特征及生理生化指标的测定结果将其鉴定为肠杆菌属的Enterobacterradicincitans。图2为根皮苷含量测定标准曲线。决定系数R2＝0.9689，符合测定要求；P﹤0.0001，表明模型极显著；得到的线性回归方程为y＝0.0926x-0.0281。说明根皮苷的浓度与吸光度呈线性关系，可以用于G-19菌株对根皮苷降解能力的测定。图3溶血实验结果。从图3可以看出，G-19菌株的溶血性试验呈阴性，符合《微生物肥料安全通用技术准则》对菌种溶血性的要求。具体实施方式：实施例一1、根皮苷降解菌G-19的分离无菌条件下取苹果树根际土壤5g，溶于45mL根皮苷浓度为500mg/L的富集培养基(组分为：蛋白胨10.0g、氯化钠1.0g、磷酸氢二钾1.0g和水1000ml，pH值7.0-7.2)中，摇瓶培养，转速：180～200r/m，温度：28～32℃。此后每3d为一个训化周期，每个周期的富集培养基中根皮苷浓度由500mg/L依次递增至：1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L、2500mg/L,每个周期培养结束时，将得到的发酵液以体积比10％的接种量再接种到50ml富集培养基中继续驯化培养，各周期摇瓶培养条件相同；同时，驯化结束后吸取0.5mL根皮苷浓度为2500mg/L的发酵液与4.5mL的无菌水混匀，即得10-1的稀释液；再取0.5mL10-1的稀释液与4.5mL的无菌水混匀，即得10-2的稀释液，依稀类推，分别制备稀释度为10-1、10-2、10-3、10-4和10-5的稀释液。用移液枪吸取稀释度为10-5的稀释液100uL于PDA平板中央，用涂布器涂抹均匀，于37℃恒温培养箱培养1-3d，挑取单菌落PDA平板划线成纯培养物，保存。将上述获得的纯培养物接种到含根皮苷浓度为1000mg/L的无机盐培养基(简称：MM，其组分为：硝酸铵1.0g、硫酸铵0.5g、七水硫酸镁0.5g、氯化钠0.5g、磷酸氢二钾1.5g、根皮苷1.0g和水1L，pH值7.0-7.2)中，摇瓶培养，转速：180～200r/m，温度28～32℃。3d为一个周期，培养3个周期，3个周期后选择浑浊度较高者划线得单菌落，获得根皮苷降解菌G-19。根皮苷降解菌G-19保存方法：短期保存采用PDA固体培养基平板保存，长期保存采用甘油管保存。本专利技术涉及到的PDA培养基、液体LB培养基及固体L本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株分离的根皮苷降解菌G‑19菌株，其保藏号为CGMCC NO.9841，于2014年11月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一株分离的根皮苷降解菌G-19菌株，其保藏号为CGMCCNO.9841，于2014年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；其16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示。2.一种微生物菌剂，包含如权利要求1所述的根皮苷降解菌G-19菌株。3.如权利要求2所述的微生物菌剂在防治苹果连作障碍中的应用。4.如权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1)菌种活化将根皮苷降解菌株G-19菌株刮取一环划线接种固体LB培养基上，28～32℃培养18～24h，挑取单菌落划线转接，培养12...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘训理，王晓辉，姜红霞，隋君康，赵旭，洒荣波，肖成泽，王伟燕，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37