本发明专利技术提供了一种纳米钻石表面修饰负载甲氨蝶呤的药物及其制备方法，以及该药物在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明专利技术首先将纳米钻石表面用交联剂聚乙二醇二胺修饰，使其通过酰胺反应与缩水甘油偶联后再利用甲氨蝶呤结构中的羧基与羟基成酯制得目标药物ND-PEG-GLY-MTX。经MTT实验和流式细胞仪测试细胞周期和凋亡实验，表明ND-PEG-GLY-MTX能够诱导肿瘤细胞凋亡且疗效强于游离MTX，其可在制备抗肿瘤药物中应用。
【技术实现步骤摘要】
纳米钻石表面修饰负载甲氨蝶呤的药物及其制备方法
本专利技术涉及纳米药物，具体涉及一种纳米钻石表面修饰后负载化疗药物甲氨蝶呤的纳米药物及其制备方法，以及该药物在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
随着当今科技发展的突飞猛进，人们赖以生存的环境日益恶劣，导致恶性肿瘤的发病率越来越高。目前临床上传统的癌症治疗方法中，化疗是最为简便有效的方法之一，但是抗癌药物多为小分子化合物，血液给药后会迅速分布于全身，对患者产生较大的毒副作用，药物损失量大，而且多次给药会使肿瘤细胞产生多药耐药性，从而使得化疗效率极低。因此研发高效低毒的新型抗癌药物尤为迫切。近年来随着纳米科学与生命科学、医学等学科的有机结合，纳米生物医学已经成为引人瞩目的新兴交叉学科之一。鉴于纳米材料的独特优点，研究开发纳米药物在医药领域具有巨大的发展前景，其中最受关注的是以纳米颗粒作为药物载体，将药物通过物理吸附或共价偶联的方式结合到纳米颗粒上用于药物输送。由于纳米钻石在目前所有碳纳米材料衍生物中具有毒性最低、生物兼容性高且表面易修饰等特点，其作为药物载体应用于生物医学领域具有很大的潜在价值。而甲氨蝶呤作为临床上应用较多的抗叶酸类化疗药物，血液给药后在全身循环过程中损伤正常细胞的同时导致药物损失。鉴于纳米钻石载药及运输药物的优越性，我们将修饰后的纳米钻石通过化学偶联甲氨蝶呤制备成纳米药物，并研究其对肿瘤细胞活性、周期、凋亡等的影响。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种纳米钻石表面修饰负载甲氨蝶呤的药物及其制备方法，以及该药物在抗肿瘤药物中的应用。本专利技术提供的一种纳米钻石表面修饰负载甲氨蝶呤的药物的制备方法，包括如下步骤：(1)称取干燥的羧基化的纳米钻石，按每1mg羧基化的纳米钻石加入1-1.5mL浓度为0.1M、pH5.8的MES缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，再按每1mg羧基化的纳米钻石中加入0.2mgEDC与0.3mgNHS，室温搅拌反应6h，计时结束后以15000rpm离心5min，弃去上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；(2)把活化羧基的纳米钻石沉淀物分散到浓度为0.1M、pH8.4的硼酸缓冲溶液中，超声分散形成悬浊液，按每1mg活化羧基的纳米钻石加入0.5mgH2N-PEG-NH2，继续室温搅拌反应12h，待反应结束后，用浓度为0.1M、pH8.4的硼酸缓冲溶液以15000rpm离心5min洗涤3次，获得纳米钻石-聚乙二醇二胺(ND-PEG-NH2)沉淀物；(3)按每1mgND-PEG-NH2沉淀物溶于0.5mL无水乙醇中，超声分散30min，形成悬浊液，按每1mgND-PEG-NH2沉淀物逐滴加入体积分数为1％的缩水甘油的乙醇溶液0.5mL，再加入几滴三乙胺，维持反应体系pH在8-9，室温避光搅拌反应24h，得到沉淀物，分别用无水乙醇和灭菌双蒸水以15000rpm离心5min洗涤3次，得到纳米钻石-聚乙二醇二胺-缩水甘油(ND-PEG-GLY)载体，放在真空干燥箱里避光保存；(4)按每1mg干燥的ND-PEG-GLY加入1mL灭菌双蒸水中，避光超声分散30min形成悬浊液，接着按ND-PEG-GLY与甲氨蝶呤(MTX)质量比5︰1-3加入MTX，再按每1mgMTX中加入0.6mgEDC与0.35mgNHS在37℃水浴环境中避光反应24h，以15000rpm离心5min，用灭菌双蒸水洗涤3次，制得纳米钻石表面修饰负载甲氨蝶呤的药物ND-PEG-GLY-MTX，真空干燥，冷藏。与现有技术相比本专利技术的有益效果：本专利技术选用的纳米钻石材料具有生物相容性好、无毒、化学性质稳定、表面易修饰等诸多优点。通过纳米载体ND-PEG-GLY与人宫颈癌细胞(HeLa)作用，表明ND-PEG-GLY具有生物兼容性；将纳米载体ND-PEG-GLY通过酯键偶联化疗药物甲氨蝶呤(MTX)，制备成ND-PEG-GLY-MTX纳米药物，经MTT实验和流式细胞仪测试细胞周期和凋亡实验表明ND-PEG-GLY-MTX能够诱导肿瘤细胞凋亡且疗效强于游离MTX，其可在制备抗肿瘤药物中应用。附图说明图1A用流式细胞仪检测HeLa细胞的散点图图1B用流式细胞仪检测HeLa细胞摄取纳米药物ND-PEG-GLY-MTX的散点图图2纳米药物ND-PEG-GLY-MTX对体外培养HeLa细胞活性的影响图3A用流式细胞仪检测HeLa细胞周期的结果图3B用流式细胞仪检测甲氨蝶呤MTX影响HeLa细胞周期的结果图3C用流式细胞仪检测纳米载体ND-PEG-GLY影响HeLa细胞周期的结果图3D用流式细胞仪检测纳米药物ND-PEG-GLY-MTX影响HeLa细胞周期的结果图3E图3A-D细胞周期各时相比较的柱状图图4各实验组随着处理时间的延长对细胞凋亡影响的柱状图图5细胞内吞纳米药物ND-PEG-GLY-MTX机制具体实施方式以下为实施例中使用的材料：纳米钻石(ND，元素六，直径大约140nm,Ireland)。甲氨蝶呤(MTX)是抗叶酸类化疗药物，分子式为C20H22N8O5，分子量为454.45，江苏恒瑞医药股份有限公司生产，规格按C20H22N8O5计算为100mg。缩水甘油(GLY，分子量74.08)为Sigma公司生产。聚乙二醇二胺(H2N-PEG-NH2，分子量为2000)为上海西宝生物有限公司生产。实施例1：(1)纳米钻石-聚乙二醇二胺(ND-PEG)复合物的制备准确称取5mg羧基化的纳米钻石，在70℃真空干燥箱干燥一夜，置于5mLMES(0.1M，pH5.8)缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，接着加入1.0mgEDC、1.5mgNHS，室温搅拌反应6h，以15000rpm离心5min，除去上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；把活化羧基的纳米钻石重新分散到硼酸(BBS，0.1M，pH8.4)缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，加入2.5mgH2N-PEG-NH2，继续室温搅拌反应12h，用硼酸缓冲溶液(BBS，0.1M，pH8.4)以15000rpm离心5min洗涤3次，获得纳米钻石-聚乙二醇二胺(ND-PEG-NH2)沉淀物，真空干燥备用。(2)纳米钻石-聚乙二醇二胺-缩水甘油(ND-PEG-GLY)纳米载体的制备准确称取5mg干燥的ND-PEG，接着加入2.5mL的硼酸(BBS0.1M，pH8.4)缓冲溶液，超声分散30min形成悬浊液，逐滴加入2.5mL体积分数为1％的缩水甘油乙醇溶液，然后向反应液中滴加几滴三乙胺，维持反应体系pH在8左右，室温避光搅拌反应24h，以15000rpm离心5min，除去上清液，用灭菌双蒸水洗涤两次，弃去上清液，得到ND-PEG-GLY纳米载体沉淀物，真空干燥备用。(3)纳米钻石-聚乙二醇二胺-缩水甘油-甲氨蝶呤(ND-PEG-GLY-MTX)纳米药物的制备准确称取5mg干燥的ND-PEG-GLY，超声分散重悬于5mL灭菌双蒸水中，接着将其置于37℃水浴中，然后迅速加入2mgMTX、1.2mgEDC、0.7mgNHS，避光搅拌反应24h。待反应结束后，于15000rpm离心5min，用灭菌双蒸水清洗沉淀直至上清夜无色为止，收集所有上清液并记录其体积，待测定未反应的MTX，将制得的纳米药物ND-PEG-GLY-MTX真空干本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种纳米钻石表面修饰负载甲氨蝶呤的药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)称取干燥的羧基化的纳米钻石，按每1mg羧基化的纳米钻石加入1‑1.5mL浓度为0.1M、pH5.8的MES缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，再按每1mg羧基化的纳米钻石中加入0.2mg EDC与0.3mg NHS，室温搅拌反应6h，计时结束后以15000rpm离心5min，弃去上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；(2)把活化羧基的纳米钻石沉淀物分散到浓度为0.1M、pH8.4的硼酸缓冲溶液中，超声分散形成悬浊液，按每1mg活化羧基的纳米钻石加入0.5mg H2N‑PEG‑NH2，继续室温搅拌反应12h，待反应结束后，用浓度为0.1M、pH8.4的硼酸缓冲溶液以15000rpm离心5min洗涤3次，获得纳米钻石‑聚乙二醇二胺(ND‑PEG‑NH2)沉淀物；(3)按每1mg ND‑PEG‑NH2沉淀物溶于0.5mL无水乙醇中，超声分散30min，形成悬浊液，按每1mg ND‑PEG‑NH2沉淀物逐滴加入体积分数为1％的缩水甘油的乙醇溶液0.5mL，再加入几滴三乙胺，维持反应体系pH在8‑9，室温避光搅拌反应24h，得到沉淀物，分别用无水乙醇和灭菌双蒸水以15000rpm离心5min洗涤3次，得到纳米钻石‑聚乙二醇二胺‑缩水甘油(ND‑PEG‑GLY)载体，放在真空干燥箱里避光保存；(4)按每1mg干燥的ND‑PEG‑GLY加入1mL灭菌双蒸水中，避光超声分散30min形成悬浊液，接着按ND‑PEG‑GLY与甲氨蝶呤(MTX)质量比5︰1‑3加入MTX，再按每1mgMTX中加入0.6mg EDC与0.35mg NHS在37℃水浴环境中避光反应24h，以15000rpm离心5min，用灭菌双蒸水洗涤3次，制得纳米钻石表面修饰负载甲氨蝶呤的药物ND‑PEG‑GLY‑MTX，真空干燥，冷藏。...
【技术特征摘要】
1.一种纳米钻石表面修饰负载甲氨蝶呤的药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)称取干燥的羧基化的纳米钻石，按每1mg羧基化的纳米钻石加入1-1.5mL浓度为0.1M、pH5.8的MES缓冲溶液中，超声分散30min形成悬浊液，再按每1mg羧基化的纳米钻石中加入0.2mgEDC与0.3mgNHS，室温搅拌反应6h，计时结束后以15000rpm离心5min，弃去上清液，得到活化羧基的纳米钻石沉淀物；(2)把活化羧基的纳米钻石沉淀物分散到浓度为0.1M、pH8.4的硼酸缓冲溶液中，超声分散形成悬浊液，按每1mg活化羧基的纳米钻石加入0.5mgH2N-PEG-NH2，继续室温搅拌反应12h，待反应结束后，用浓度为0.1M、pH8.4的硼酸缓冲溶液以15000rpm离心5min洗涤3次，获得纳米钻石-聚乙二醇二胺(ND-PEG-NH2)沉淀物；(3)按每1mgND-PEG-NH2沉淀物溶于0.5mL无水乙醇中，超声分散30min，形成悬浊液，按每1mgND-PEG-NH2沉淀物逐滴加入体积分数为1％的缩水甘油的乙醇溶液0.5mL，...
【专利技术属性】
技术研发人员：李英奇，王青，李林，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西;14
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