用于产生条件性敲除等位基因的方法和组合物技术

本发明专利技术提供用序列特异性核酸酶产生条件性敲除等位基因的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 相关申请的交叉参考 本申请要求2012年6月12日提交的美国临时申请号61/658, 670的权益，该美国 临时申请的公开内容在此完整引入作为参考。 序列表 本申请包含序列表，该序列表已通过EFS-Web以ASCII格式提交，在此完整引入作 为参考。于2013年6月12日创建的该ASCII拷贝命名为P4905RlTO_PCTSequenceListing. txt，大小为49, 214字节。
本专利技术涉及产生遗传改造的条件性敲除等位基因的新方法。
技术介绍
单个基因表达的选择性抑制或增强已极大地辅助了体外和体内基因功能的研究。 使用同源重组的鼠胚胎干（ES)细胞的基因靶向是用于操作鼠基因组的完善方法，且已允 许创造就所研究的基因而言的无效或"敲除"小鼠。最近，条件性或诱导性敲除技术推进 了在全身缺失时导致胚胎或围产期致死率的基因的研究（例如Lakso，M.等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA89:6232-36 (1992)Jacks,T?等，Nature359:295-300 (1992))。条件性敲除 小鼠还可以用来研究在特定组织中选择性缺失基因的作用，同时保持其在其他组织中的功 能完整。但是，用于产生条件性敲除动物的常规方法费力、低效，且需要得到胚胎干细胞。 改造的序列特异性核酸酶已用于产生敲除等位基因。这类序列特异性内切核酸 酶的实例包括锌指核酸酶（ZFN)，其由与内切核酸酶效应结构域融合的序列特异性DNA结 合结构域组成（Porteus，M.H?和Caroll，D.，Nat.Biotechnol. 23, 967-973 (2005))。序列 特异性核酸酶的另一实例是转录激活剂样效应核酸酶（TALEN)，其由与TAL效应蛋白融合 的核酸酶结构域组成（Miller,J.C?等，Nat.Biotechnol. 29, 143-148 (2011) ;Cermak，T. 等，NucleicAcidRes. 39,e82 (2011))。序列特异性内切核酸酶是自然界中的模块，通过排 列一个或多个模块来获得DNA结合特异性。例如，ZFN中的锌指结构域各识别三个碱基对 (Bibikova,M?等，Mol.Cell.Biol. 21，289 - 297(2001))，而TALEN中的单个TAL结构域各 通过唯一密码识别一个碱基对（Boch，J.等，Science326, 1509 - 1512(2009))。序列特异 性核酸酶的另一实例包括RNA指导的DNA核酸酶，例如CRISPR/Cas系统。 已用ZFN、TALEN和最近的CRISPR/Cas介导的基因编辑来有效和直接地产生基 因敲除等位基因（Geurts，A.M?等，Science325,433(2009) ;Mashimo，T?等，PLoSONE 5,e8870 (2010) ;Carbery，I.D?等，Genetics186, 451 - 459 (2010)汀688〇11，1.等，恥七 Biotech. 29,695-696(2011))。认为敲除等位基因由内切核酸酶介导的双链断裂（DSB)的 易错非同源末端连接（NHEJ)产生。 最近，ZFN在小鼠和大鼠二者中成功地用于通过所靶向的染色体基因座与供体 DNA的同源重组来革巴向插入（敲入）报道基因（Meyer,M?等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107, 15022 - 15026 (2010) ;Cui,X?等，Nat.Biotechnol. 29 (1)，64-67 (2010))。已提出供 体序列的序列特异性插入经由通过供体和发生双链断裂的基因座之间的同源重组进行的 双链断裂修复的合成依赖性链退火（SDSA)模型而发生（Moehle，E.A?等，ProcNatlAcad SciUSA104,3055 - 3060(2007))。根据此模型，内切核酸酶介导的双链断裂和链切除之 后，单链染色体末端退火至存在于供体DNA上的同源区，然后用供体插入片段作为模板进 行合成。 尽管有这些进展，但本领域仍存在对产生条件性敲除等位基因和将此技术扩展至 其他物种的新方法的需要。本专利技术满足此需要，并提供其他益处。 专利技术概述 本专利技术涉及用于产生条件性敲除等位基因的新方法和组合物。具体而言，本专利技术 涉及用特异性供体构建体与序列特异性核酸酶一起来产生条件性敲除等位基因。 在一方面，提供在包含靶基因的细胞中产生条件性敲除等位基因的方法。该方法 包括步骤： 1.向该细胞中引入供体构建体，其中该供体构建体包含5'同源区、5'重组酶识别 位点、供体序列、3'重组酶识别位点和3'同源区，其中该供体序列包含具有至少一个中性突 变的靶序列；和 2.向该细胞中引入切割靶基因内的序列的序列特异性核酸酶，从而在该细胞中产 生条件性敲除等位基因。在某些实施方案中，该序列特异性核酸酶是锌指核酸酶（ZFN)、ZFN二聚体、转录 激活剂样效应核酸酶（TALEN)或RNA指导的DNA内切核酸酶。在某些实施方案中，该序列 特异性核酸酶仅切割靶基因一次。在某些实施方案中，将该序列特异性核酸酶作为蛋白质、 mRNA或cDNA引入细胞。 在某些实施方案中，该重组酶识别位点是loxP位点、rox位点或frt位点。在某 些实施方案中，该供体序列包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个中性突变。在某些实施 方案中，该供体序列和该靶序列之间的同源性为51-99%。在某些实施方案中，该供体序列 和该靶序列之间的同源性为78%。在某些实施方案中，该供体构建体包含图4A或图4B中 所示的序列。在某些实施方案中，该5'同源区包含至少l.lkb，且其中该3'同源区包含至 少lkb。在某些实施方案中，该靶基因是Lrp5。 在另一实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，该哺乳动物细胞 是小鼠、大鼠、兔、仓鼠、猫、狗、绵羊、马、牛、猴或人细胞。在某些实施方案中，该细胞来自非 人动物。在某些实施方案中，该细胞是体细胞、合子或多能干细胞。 在另一方面，提供产生条件性敲除动物的方法，该方法包括步骤： 1.向包含靶基因的细胞中引入供体构建体，其中该供体构建体包含5'同源区、5' 重组酶识别位点、供体序列、3'重组酶识别位点和3'同源区，其中该供体序列包含具有至少 一个中性突变的靶序列； 2.向该细胞中引入序列特异性核酸酶，其中该核酸酶切割靶基因；和 3.将该细胞引入载体动物中，以从该细胞产生条件性敲除动物。 在一些实施方案中，该动物是小鼠、大鼠、兔、仓鼠、豚鼠、狗、绵羊、猪、马、牛或猴。 在某些实施方案中，该细胞来自非人动物。在一些实施方案中，该细胞是合子或多能干细 胞。 在另一方面，提供产生敲除动物的方法，该方法包括步骤： 1.向包含靶基因的合子中引入供体构建体，其中该供体构建体包含5'同源区、5' 重组酶识别位点、供体序列、3'重组酶识别位点和3'同源区，其中该供体序列包含具有至少 一个中性突变的靶序列； 2.向该合子中引入序列特异性核酸酶，其中该核酸酶切割靶基因； 3.将该合子引入载体动物中，以从该合子产生条件性敲除动物；和 4.使该条件性敲除动物与具有编码催化5'和3'重组酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
在包含靶基因的细胞中产生条件性敲除等位基因的方法，所述方法包括步骤：a.向所述细胞中引入供体构建体，其中供体构建体包含5’同源区、5’重组酶识别位点、供体序列、3’重组酶识别位点和3’同源区，其中供体序列包含具有至少一个中性突变的靶序列；和b.向所述细胞中引入切割所述靶基因内的序列的序列特异性核酸酶，从而在所述细胞中产生条件性敲除等位基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·瓦明，K·R·安德森，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH