本发明专利技术属于基因疫苗领域，公开了一种非抗性筛选KISS1真核表达质粒pVAX-KISS1-S-asd，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术还公开了一株含有所述非抗性筛选KISS1真核表达质粒pVAX-KISS1-S-asd的重组大肠杆菌x6097/pVAX-KISS1-S-asd，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO:M2014503。该菌株可用于大量提取质粒pVAX-KISS1-S-asd，制备一种动物免疫去势基因疫苗。将本发明专利技术制备的重组疫苗免疫湖羊公羔，能够有效诱导其免疫应答，抑制其性腺功能和性行为，达到免疫去势的目的。本发明专利技术制备的非抗性筛选免疫去势基因疫苗成本低廉，效果显著，使用方便，安全可靠，易于保存，可用于各种哺乳动物的免疫去势。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因疫苗领域。具体涉及一种非抗性筛选KISS1真核表达质粒，含有 该真核表达质粒的重组大肠杆菌，以及该重组大肠杆菌在制备动物免疫去势基因疫苗中的 应用，本专利技术还涉及一种动物免疫去势基因疫苗的制备方法。
技术介绍
家畜去势术在我国具有久远的历史，最早记载于夏代《夏小正》中，把对公畜去势 称为攻驹或攻特。目前，家畜去势方法还主要沿用手术阉割。中国家畜年出栏量巨大，其中 包括6亿头猪和3亿头羊（米春改.全国畜牧业发展概况.中华人民共和国年鉴，2012)。 畜牧生产中主要对公畜去势，母畜基本不去势。每年大约就有3亿头公猪和1亿头公羊采 取手术去势，工作量巨大，成本很高，而且易感染。同时，规模化标准化生产中动物福利、成 本控制、熟练劳动力稀缺等新需求和新形势迫使开发方便高效，成本低廉的去势新技术和 新方法。在众多去势方案中，激素免疫去势在规模化标准化大生产中最有应用潜力。免疫 去势的技术关键在于免疫靶标的选择。激素免疫去势主要以下丘脑-垂体-性腺轴中的 生殖激素成员为靶标（靶基因或靶蛋白）。GnRH、FSH和LH是免疫去势常用的靶标（韩 燕国，等.动物GnRH-I免疫去势的研宄进展.生理科学进展，2013,44(5):399-401;姜勋 平，等.基因免疫原理和方法.北京：科学出版社，2004)。FSH或LH蛋白疫苗免疫后在 抑制动物睾酮分泌、精子发生和精液品质上均有一定的抑制效果（FalvoRE，等.Effect ofactiveimmunizationagainstLHRHorLHinboars:reproductiveconsequences andperformancetraits.JAnimSci, 1986,63(3) :986-94；FerroVA.Current advancesinantifertilityvaccinesforfertilitycontrolandnoncontraceptive applications.ExpertRevVaccines，2002, 1 (4) :443-52)D 但是，它们的共同问题是免疫 动物后抗体水平不高，去势效果不明显。于是，研究者除了寻找改善免疫效果的方法外， 更多地将研究视角转向生殖轴的上一级成员GnRl兽用GnRH蛋白疫苗（如Improvac和 Bopriva)已经可以达到去势的目的（BruniusC，等.Earlyimmunocastrationofmale pigswithImprovac(?)-effectonboartaint,hormonesandreproductiveorgans. Vaccine，2011，29(51) :9514-20)。但是，这种蛋白型去势疫苗操作复杂，成本高。鉴于此， 研究者构建了低成本的GnRH基因疫苗用于动物免疫去势，试验结果表明受免小鼠雄激素 水平降低、睾丸萎缩和精子发育受阻等（叶文剑等.GnRH基因疫苗构建及免疫去势效果 评价.武汉：华中农业大学图书馆，2012;KhanMAH，等?Immunisationwithaplasmid DNAvaccineencodinggonadotrophinreleasinghormone(GnRH-I)andT-helper epitopesinsalinesuppressesrodentfertility.Vaccine, 2008, 26(10):1365-1374 ； KhanMAH,等?ImmunisationofmalemicewithaplasmidDNAvaccineencoding gonadotrophinreleasinghormone(GnRH-I)andT-helperepitopessuppresses fertilityinvivo.Vaccine，2007,25(18):3544-53)，但没有完全抑制精子的发生。因 此，为了使开发的基因疫苗达到免疫去势的目的，必须提高基因疫苗在机体内表达效率 或寻找新的免疫去势靶标。KISS1由下丘脑分泌，处于生殖轴控制的最上游，通过控制GnRH的分泌起到繁殖控制开关的决定性作用，将其敲出或突变后严重降低了动物的繁 殖性能(SuzukiS,等?Directkisspeptin-lOstimulationonluteinizinghormone secretionfrombovineandporcineanteriorpituitarycells.AnimalReproduction Science, 2008, 103(3-4) :360-5；ClarkeIJ,等?Kisspeptinstimulatesovulationin seasonallyacylicewes.InProc89thAnnualMeetingoftheEndocrineSociety. Toronto,Ontario,Canada, 2007；LapattoR,等?Kissl-/_miceexhibitmorevariable hypogonadismthanGpr54-/_mice.Endocrinology, 2007, 148(10) :4927-36)。对于免疫去 势疫苗的靶标而言，下丘脑-垂体-性腺轴上游的激素成员用于免疫去势的效果上游要比 下游的好，例如GnRH免疫去势效果就比FSH或LH的好。由此推论，用处于生殖轴最上游的 KISS1基因免疫去势效果可能比GnRH还好。为此，需进一步用基因免疫的新方法展开KISS1 新靶标免疫去势效果的研宄。 免疫去势基因疫苗（如GnRH)的载体中普遍存在着抗性筛选标志基因（Amp 或Kan)。在培养细菌的过程中需要添加此类抗性物质来筛选重组菌，不仅增加了成 本，也有可能导致临床抗药菌株的播散和基因疫苗产品制备过程中潜在的痕量过敏 现象(HanYG,等.EfficacyandsafetyofanoralsomatostatinDNAvaccine withoutantibioticresistancegeneinpromotinggrowthofpiglets.ScandJ Immunol, 2014, 79(4) : 244-50)，从而不利于疫苗的推广应用。因此，关于携带目的基因的 载体尚需进一步研宄改进。此外，免疫去势基因疫苗中的靶标（如GnRH)通常分子量小， 免疫原性弱，为了保证其较好的免疫原性，免疫去势基因疫苗中的靶标需要同大分子载体 连接起来。大量研宄证明，基因疫苗的靶标与大分子的乙肝表面抗原S基因结合能够有效 提高疫苗的免疫原性（LiangAX，等?Constructionandevaluationoftheeukaryotic expressionplasmidencodingtwocopiesofsomatostatingenesfusedwith hepatitisBsurfaceantigengeneS.Vaccine, 2008,26:2935 - 41)〇
技术实现思路
本专利技术的目的是构建一种新的、针对免疫去势上游靶标KISS1的基因疫苗，本发 明还提供一种非抗性筛选KISS1真核表达质粒，以及含有该真核表达本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种非抗性筛选KISS1真核表达质粒pVAX‑KISS1‑S‑asd，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姜勋平，韩燕国，刘桂琼，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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