一种基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌载体的构建方法技术

本发明专利技术提供了一种基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌载体的构建方法，将受体菌C78-3与含有manA、crp、relA和asd缺失的自杀载体大肠杆菌供体菌结合，在野生型猪霍乱沙门氏菌C78-3中分别引入突变ΔmanA，ΔPcrp::TT araC PBAD crp，ΔrelA::araC PBAD lacI TT和ΔasdA，引入这些突变后的猪霍乱沙门氏菌称为χ0011；并对四种突变进行表型鉴定。本发明专利技术可以使野生型猪霍乱沙门氏菌成为许多外源抗原的安全，有效的疫苗载体；为各种猪病，尤其是猪的许多细菌病提供由基因调控提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌减毒载体，具有极大的市场应用性。

【技术实现步骤摘要】
一种基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌载体的构建方法
本专利技术属于生物
，特别涉及一种将野生型猪霍乱沙门氏菌毒力基因逐渐缺失的构建方法。
技术介绍
沙门氏菌作为一种侵袭性胞内菌，其减毒后具有优先的侵袭能力，在体内生长缓慢，能够有效地持续刺激机体产生强有力的细胞免疫和体液免疫以及局部粘膜免疫。另外,沙门氏菌载体具有免疫佐剂作用,其LPS作为一种内在佐剂,可以刺激宿主细胞释放各种细胞因子。因此，减毒沙门氏菌在诱导体液和细胞免疫反应方面比灭活苗或者亚单位苗更有效。基因工程方法致弱的鼠伤寒沙门氏菌已被用作基因载体广泛表达外源基因,用于肿瘤、病毒病、细菌病、寄生虫病等的治疗研究,并取得良好效果。但是在许多研究报道中的沙门氏菌载体，要么使减毒载体过度减毒，失去了免疫原性；或者保留了良好的免疫原性，但是载体菌株却减毒不够，缺乏安全性而不能作为疫苗。因此迫切需要研制这样的一种疫苗载体，既要使疫苗载体足够减毒，保证动物完全的安全，又要使疫苗载体和其携带的外源抗原能够诱导出优秀的保护性抗体，抗击相关病原的感染。2008年，CurtissR实验室首次使用pmi缺失和araCPBAD激本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)选择作为构建χ0011株的野生型猪霍乱沙门氏菌毒株C78‑3作为受体菌；(2)构建基因、启动子缺失和插入araC PBAD结构的自杀载体，即ΔmanA，ΔPcrp::TT araC PBAD crp，ΔrelA::araC PBAD lacI TT和ΔasdA；(3)同源重组法将上一步的含有的基因或启动子缺失的自杀载体引入野生型猪霍乱沙门氏菌毒株C78‑3中，引入这些突变后的猪霍乱沙门氏菌称为χ0011；(4)对四种突变进行表型鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种基因调控延迟减毒和提高表达外源抗原猪霍乱沙门氏菌载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)选择作为构建χ0011株的野生型猪霍乱沙门氏菌毒株C78-3作为受体菌；(2)构建基因、启动子缺失和插入araCPBAD结构的自杀载体，即ΔmanA，ΔPcrp::TTaraCPBADcrp，ΔrelA::araCPBADlacITT和ΔasdA；(3)同源重组法将上一步的含有的基因或启动子缺失的自杀载体引入野生型猪霍乱沙门氏菌毒株C78-3中，引入这些突变后的猪霍乱沙门氏菌称为χ0011；(4)对四种突变进行表型鉴定；所述猪霍乱沙门氏菌减毒突变株χ0011，保藏在位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日为2014年11月14日，保藏编号为CGMCCNO.9968,该生物材料的分类命名为:猪霍乱沙门氏菌减毒株,拉丁文学名为:SalmonellaCholeraesuis；其中，步骤（2）具体包括：1）缺失crp基因的自杀载体的构建在Genbank中搜索猪霍乱沙门氏菌的全基因序列，找到猪霍乱沙门氏菌的crp基因及其上游序列，在crp基因和上游基因中设计同源臂序列引物，删除crp基因启动子区的95个核苷酸，然后插入转录终止子TT和araCPBAD激活启动子序列1335bp，其删除和插入的系统为crp基因上游yhfA部分序列、删除crp基因启动子区的95个核苷酸、1335bp的转录终止子TT和araCPBAD激活启动子序列、删除95bpcrp基因启动子后的crp序列，全称为ΔPcrp::TTaraCPBADcrp；具体步骤是以猪霍乱沙门氏菌C78-3为模板，由引物P1和P2经PCR获得yhfA同源臂区，称为片段1；由引物P3和P4经PCR获得删除crp基因启动子区的95个核苷酸后其余的crp基因中356bp同源臂称为片段2；由引物P5和P6经PCR获得TTaraCPBAD结构序列，称为片段3；片段1与片段3经平端连接，连接产物转化至pGEM-TEasyVector克隆载体；将其连接序列酶切后补平，与片段2平端连接，连接产物转化至pGEM-TEasyVector克隆载体，产生ΔPcrp::TTaraCPBADcrp结构序列，将阳性质粒送至Takara公司测序，获得正确的序列后，经SphI和SacI酶切，酶切产物连接至具有氯霉素和乳糖筛选标记的自杀载体pRE112中，通过酶切鉴定和序列测定，将正确的ΔPcrp::TTaraCPBADcrp结构自杀载体电转化至工程菌大肠杆菌χ7213中，称为χ7213(pYAs001)，保存在-20℃冰箱中备用；构建ΔPcrp::TTaraCPBADcrp自杀载体的引物：P1:5`-acatgcatgcATCTCCATCGGACTCGGCGCTTT-3`P2:5-`catctgcagTTGTAGCCTGTAATGTGATGTCC-3`P3:5`-ccgctcgagAGGATAACCGCGCATGGTGC-3`P4:5`-tgcgagctcCAGAATATCCGGGTTGACCTG-3`P5:5`-GCCCTGCAGAGATCTCCTGGTACCTAGGCCTCTAGATAAATAAAAGCAGTTTACAACTCCTAGAATTGTGAATATATTATCACAATTCTAGGATAGAATAATAAA-3`P6:5`-AGAGGTACCCTCGAGGCTAGCCCAAAAAAACGGG-3`；2）缺失manA基因的自杀载体的构建在Genbank中搜索猪霍乱沙门氏菌的全基因序列，找到猪霍乱沙门氏菌的manA基因及其上下游序列，在上下游基因中设计引物，以上下游基因的300bp左右为同源臂，删除manA基因，共计1176bp；具体步骤是以猪霍乱沙门氏菌C78-3为模板，由引物P1和P2经PCR获得ydgA同源臂基因序列，称为片段1；由引物P3和P4经PCR获得fumA基因的同源臂序列，称为片段2；将片段1和片段2补平后进行平端连接，连接转化至pGEM-TEasyVector克隆载体，提取阳性质粒，送至Takara公司进行序列测定；取正确序列的ΔmanA结构经KpnI和SacI酶切，连接至具有氯霉素和乳糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：石火英，吉贞颖，尚竞，李玉安，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32