本发明专利技术公开了一种多重信号放大的免标记电化学传感器的制备方法，连接探针1和捕获探针在金纳米粒子上固定，即S1-CP-AuNPs聚合物；在基底电极表面修饰CS-GR复合物，浸在连接探针2中，得S2/CS-GR/基底电极；将S2/CS-GR/基底电极浸在S1-CP-AuNPs聚合物中，通过S1和S2间碱基互补配对将S1-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/基底电极上，即传感器S1-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。本发明专利技术还提供了一种依据上述方法制备的电化学传感器。所述的传感器可用于核酸的检测，该传感器具有很高的灵敏性，而且免标记，对p53基因检测范围10-15～10-9mol/L，检测限0.3×10-15mol/L。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种多重信号放大的免标记电化学传感器的制备方法，连接探针1和捕获探针在金纳米粒子上固定，即S1-CP-AuNPs聚合物；在基底电极表面修饰CS-GR复合物，浸在连接探针2中，得S2/CS-GR/基底电极；将S2/CS-GR/基底电极浸在S1-CP-AuNPs聚合物中，通过S1和S2间碱基互补配对将S1-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/基底电极上，即传感器S1-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。本专利技术还提供了一种依据上述方法制备的电化学传感器。所述的传感器可用于核酸的检测，该传感器具有很高的灵敏性，而且免标记，对p53基因检测范围10-15～10-9mol/L，检测限0.3×10-15mol/L。【专利说明】-种多重信号放大的免标巧电化学传感器及对核酸的检测
本专利技术设及核酸的检测方法，特别是一种多重信号放大的免标记电化学传感器及 对核酸的检测。
技术介绍
现知人类的疾病都与基因有着直接或间接的关系，P53基因是人体重要的抑癌基 因，使癌细胞自杀，防止癌变，还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。一旦p53基因发生突 变，将会加快肿瘤的生长和癌症的发展。因此，对核酸的高灵敏、高选择性的快速检测方法 存在着越来越迫切的需求，该对于基因研究、药物筛选W及临床诊断都有现实意义。 [000引 目前，用来检测核酸的方法主要有；DNA印迹、RNA印迹和PCR技术，该些方法操作 中的一个共同点是必须把未杂交的探针和引物与杂交体分离后才能借助其他信号对祀核 酸进行准确定量检测。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种多重信号放大的免标记电化学传感器及对 核酸的检测，所述的电化学传感器具有很高的灵敏性，而且免标记。 本专利技术的另一目的还在于提供一种快速、高灵敏度的核酸检测方法。 本专利技术是通过W下技术方案实现的： 一种多重信号放大的免标记电化学传感器的制备方法，技术方案如下： [000引 （1)连接探针1和捕获探针在金纳米粒子上固定，形成连接探针1-捕获探针-金 纳米粒子聚合物，即Sl-CP-AuNPs聚合物，其中，连接探针1的核巧酸序列为5'-SH-C6-TTT TTC GTG AGC AGC GTC AG-3'，如序列表中SEQ ID NO. 1所示，捕获探针的核巧酸序列为 5'-SH-C6-AAA GGG TTG GGC GGG ATG GGT TGA GTC TTC C i AG TGT GAT GAA ACC CAT C-3'，如序列表中SEQ ID NO. 2所示； (2)石墨締分散在壳聚糖溶液中，形成壳聚糖-石墨締聚合物，即CS-GR复合物； (3)在基底电极表面修饰CS-GR复合物，得壳聚糖-石墨締/基底电极，即CS-GR/ 基底电极； (4)将壳聚糖-石墨締/基底电极处理后，浸在连接探针2中，得连接探针2/ 壳聚糖-石墨締/基底电极，即S2/CS-GR/基底电极，其中，连接探针2的核巧酸序列为 5, -NH2-C6-TTT TTTTCT GAC GCT GCT CAC G-3，，如序列表中 SEQ ID NO. 3 所示； (5)将S2/CS-GR/基底电极浸在Sl-CP-AuNPs聚合物中，通过S1和S2间碱基互补 配对将Sl-CP-AuNPs固定在S2/CS-GR/基底电极上，制得连接探针1-捕获探针-金纳米粒 子/连接探针2/壳聚糖-石墨締/基底电极，即传感器Sl-CP-AuNPs/S2/CS-GR/GCE。 [001引所述步骤似中壳聚糖溶液的质量分数为0. Iwt%?0. 5wt%。 优选地，所述步骤（3)中，基底电极为玻碳电极。 所述步骤（1)中连接探针1和捕获探针在金纳米粒子上固定，连接探针1和捕 获探针中分别加入=(2-氯己基）磯酸醋TCEP，室温避光处理1小时；将上述两溶液混 合加入到金纳米粒子中，室温避光揽拌；揽拌的过程中逐滴加入=哲甲基氨基甲烧-盐酸 缓冲液Tris-HCl，再逐滴加入化C1溶液，室温避光揽拌；将上述溶液离屯、，将沉淀重新分 散在Tris-HCl和化C1的混合溶液中，即得连接探针-捕获探针-金纳米粒子聚合物，即 Sl-CP-AuNPs 聚合物。 所述步骤（3)中，玻碳电极用S氧化二侣粉打磨成镜面后清洗，惊干后，将CS-GR 复合物滴涂在玻碳电极上，室温惊干，制得壳聚糖-石墨締/玻碳电极，即CS-GR/GCE。 所述步骤（4)中，壳聚糖-石墨締/玻碳电极浸在戊二醒溶液中，然后清洗；将清 洗后的壳聚糖-石墨締/玻碳电极浸在连接探针S2中，制得连接探针/壳聚糖-石墨締/ 玻碳电极，即S2/CS-GR/GCE ;其中，戊二醒溶液的质量分数为1. 5%?5%。 步骤（3)中所述清洗，是在二次水中清洗3?5分钟，然后依次在己醇和二次水中 超声3?5分钟。 步骤（4)中所述清洗，是分别在化OH溶液和lOmmol/L pH 7. 4的Tris-肥1缓冲 液中。 本专利技术还提供了一种根据上述方案制备的免标记电化学传感器。 本专利技术的另一目的是提供上述电化学传感器在检测核酸含量的应用，包括W下步 骤： [002引 （1)标准溶液配制：配制一组含有不同浓度P53基因的抑为7. 4的Tris-肥1缓 冲溶液为标准液； (2)建立工作曲线；将所述传感器分别浸入标准溶液中40°C解育80分钟，解育后 用Tris-HCl缓冲液冲洗，再将传感器分别浸入肥Buffer 3、氯高血红素、亚甲基藍溶液中， 每次浸入后均用Tris-HCl缓冲液冲洗，在lOmL Tris-HCl、KC1和&〇2的混合溶液中进行 差分脉冲伏安法值PV)扫描，记录响应电流I (uA)，所述I值与标准溶液中p53基因浓度 c(mol/L)的对数log C成正比，绘制I-log C标准曲线，或采用线性回归法得到I-log C线 性回归方程； (3)p53基因含量测定；将待测样品配制为含有步骤（1)相同浓度P53基因的 Tris-HCl缓冲溶液，按照与步骤（2)相同的方法对所述传感器进行解育和进一步反应后进 行差分脉冲伏安扫描，记录响应电流I ;根据响应电流I和I-log C线性回归方程，得到p53 基因含量。 [002引步骤（1)中所述Tris-HCl缓冲溶液的浓度为lOOmmol/L，步骤似中所用 Tris-HCl的浓度均为lOmmol/L，所述步骤（2)中肥Buffer 3含有0.加nit/ y L N. BstNB lo 本专利技术的有益效果为； 1.本专利技术建立了一种基于多重信号放大、免标记的电化学适体传感器用于超灵敏 检测p53基因，其中多重信号放大策略包括；（1)壳聚糖-石墨締复合物基底有利于电子在 电极表面的转移；(2)具有高比表面积的金纳米粒子AuNPs可W固定更多的捕获探针CP ; (3)在切刻内切酶N.BstNB I的作用下，p53基因能重复利用，从而在酶切后产生更多的富 鸟嚷岭G结构，并在氯高血红素hemin和K+的存在下形成DNA酶DNAzyme ; (4)DNAzyme催 化&化还原，同时促进了亚甲基藍MB的氧化还原；W上方案本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多重信号放大的免标记电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)连接探针1和捕获探针在金纳米粒子上固定，形成连接探针1‑捕获探针‑金纳米粒子聚合物，即S1‑CP‑AuNPs聚合物，其中，连接探针1的核苷酸序列为5’‑SH‑C6‑TTT TTC GTG AGC AGC GTC AG‑3’，捕获探针的核苷酸序列为5'‑SH‑C6‑AAA GGG TTG GGC GGG ATG GGT TGAGTC TTC C↓AG TGT GAT GAA ACC CAT C‑3'；(2)石墨烯分散在壳聚糖溶液中，形成壳聚糖‑石墨烯聚合物，即CS‑GR复合物；(3)在基底电极表面修饰CS‑GR复合物，得壳聚糖‑石墨烯/基底电极，即CS‑GR/基底电极；(4)将壳聚糖‑石墨烯/基底电极处理后，浸在连接探针2中，得连接探针2/壳聚糖‑石墨烯/基底电极，即S2/CS‑GR/基底电极，其中，连接探针2的核苷酸序列为5’‑NH2‑C6‑TTT TTT TCT GAC GCT GCT CAC G‑3’；(5)将S2/CS‑GR/基底电极浸在S1‑CP‑AuNPs聚合物中，通过S1和S2间碱基互补配对将S1‑CP‑AuNPs固定在S2/CS‑GR/基底电极上，制得连接探针1‑捕获探针‑金纳米粒子/连接探针2/壳聚糖‑石墨烯/基底电极，即传感器S1‑CP‑AuNPs/S2/CS‑GR/GCE。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：夏建飞，张菲菲，杨敏，王宗花，宋岱珉，毕赛，桂日军，李延辉，夏延致，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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