姜黄挥发油中芳姜黄酮对照品的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种姜黄挥发油中芳姜黄酮对照品的制备方法，本发明专利技术以姜黄挥发油为原料，以硅胶柱层析和制备型高效液相色谱为分离手段，以一定比例的石油醚-乙酸乙酯，甲醇-水为洗脱体系，所制备获得的芳姜黄酮纯品，经HPLC检测，在不同色谱柱和流动相测定结果均为一个主色谱峰，改变色谱柱和流动相测定均未出现异常峰，以面积归一化法测定对照品纯度大于99%，符合含量测定用中药化学对照品的要求。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种，本专利技术以姜黄挥发油为原料，以硅胶柱层析和制备型高效液相色谱为分离手段，以一定比例的石油醚-乙酸乙酯，甲醇-水为洗脱体系，所制备获得的芳姜黄酮纯品，经HPLC检测，在不同色谱柱和流动相测定结果均为一个主色谱峰，改变色谱柱和流动相测定均未出现异常峰，以面积归一化法测定对照品纯度大于99%，符合含量测定用中药化学对照品的要求。【专利说明】
本专利技术涉及一种分离纯化技术，尤其是一种姜黄挥发油中芳姜黄酮对照品的制备 方法。
技术介绍
姜黄为姜科姜黄属（Curcuma)植物姜黄的干燥根茎。姜黄作为传统中药，始载于 《唐本草》，具有破血行气、通经止痛的功能，现代医学研究表明，姜黄具有抗炎，抗氧化，清 除自由基，抗微生物及抗肿瘤作用。近年来它被用于治疗高血脂症和具有抗肝毒作用。 芳姜黄酮作为姜黄的一种重要成分，属于萜烯类化合物，在医学方面的研究涉及 诱导肿瘤细胞凋亡、抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、抗真菌、抗生育、抗蛇毒等功效，对临 床开发治疗白血病、恶性淋巴肿瘤、细菌炎症、真菌炎症、甚至糖尿病、肥胖等代谢综合性疾 病及节育等方面都有广阔的前景。 姜黄消痤搽剂的有效成分是姜黄挥发油，挥发油的主要成分是芳姜黄酮。以芳姜 黄酮作为功能性指标测定姜黄消痤搽剂质量控制体系对进一步保证疗效，加强质量可控性 具有重要意义。如何从姜黄挥发油中获得高纯度的芳姜黄酮对照品，是需要解决的。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种姜黄挥发油中芳姜黄酮对照品的制备方 法，它能从姜黄挥发油中分离获得纯度极高的芳姜黄酮。 本专利技术是这样实现的：，以姜黄挥发油 为原料，包括如下工艺步骤： (1) 加压正相硅胶柱粗分离：将原料与硅胶按I :10-1 :15的质量比，以体积比为 30:1-15:1的石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，加压柱层析，通过点薄层板，以石 油醚-乙酸乙酯展开，石油醚与乙酸乙酯的体积比为15:1-25:1，在紫外下观察，收集极性 相近的混合物，分离得到粗分离物； (2) 加压正相硅胶柱细分离：将粗分离物加硅胶，首次加入的原料与细分离的硅胶的 质量比为1:10-1:15,以体积比为100:1-50:1的石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗 脱，加压柱层析，通过点薄层板，以石油醚-乙酸乙酯展开，石油醚与乙酸乙酯的体积比为 25:1-15:1，在紫外下观察，收集极性非常接近的混合物，分离得到细分离物； (3) 制备高效液相色谱分离得到芳姜黄酮对照品：将细分离物中加入丙酮，细分离物与 丙酮的体积比为I :5-1:10,以甲醇和水为流动相，甲醇与水的体积为60 :40-90:10,流速 为5-10 mL/min，15-17分钟出峰，20-22分钟结束，收集得到纯度为99%以上的芳姜黄酮纯 品。 为了进一步验证本专利技术的技术效果，进行了如下实验： 芳姜黄酮单体化合物的分离 1. 1硅胶柱层析粗分离 称取姜黄挥发油10 g，用石油醚溶解于瓷蒸发皿中，以12 g硅胶拌样，挥干溶剂，备用； 按1:10用100 g硅胶（300-400目），以石油醚-乙酸乙酯（15:1)湿法上柱；待柱中硅胶层 不再下移后再上样，并以石油醚-乙酸乙酯（15:1)进行加压洗脱，通过点薄层板，以石油 醚-乙酸乙酯（15:1)展开，在254nm下观察，收集Rf 0. 7处极性相近的混合物，得7. 3g。 1. 2硅胶柱层析细分离 称取粗分离得到的混合物7.3 g，用石油醚溶解于瓷蒸发皿中，以10 g硅胶拌样，挥干 溶剂，备用；用110 g硅胶（300-400目），以石油醚-乙酸乙酯（50:1)湿法上柱；待柱中硅 胶层不再下移后再上样，并以石油醚-乙酸乙酯（50:1)进行加压洗脱，通过点薄层板，以石 油醚-乙酸乙酯（25:1)展开，在254 nm下观察，收集Rf 0.5处极性非常接近的混合物，得 5. 2 g〇 对分离得到的混合物通过HPLC进行检测。HPLC条件为柱子Hedera C18( 200 mm)， 流动相甲醇-水（90:10)，柱温25°C，检测波长254 nm，进样量15 yL，测定结果如图2所 示，发现混合物为3个组分，从左至右分别定为1，2，3。 1.3制备型高效液相分离 对硅胶柱层析细分离得到的三个组分通过使用Agilent 1260型制备液相，以安捷伦 公司Agilent ZORBAX SB-C18 (21.2X250 _，5 μ m)色谱柱进行分离，取硅胶柱层析细 分离得到的混合物I mL，溶解于5 mL甲醇中进行稀释，流动相分别选取甲醇-水：95:5， 90:10,85:75,80:20,75:25，流速分别选取2 1111711^11，5 1111711^11，8 1111711^11，10 1111711^11， 12 mL/min，从中确定最佳分离条件。最后确定最佳分离条件流动相为甲醇-水（80:20)， 流速10 mL/min。分别收集到3个组分，经旋转蒸发仪将溶剂旋干，得纯化产品1，2，3,经 MS，1H-NMR, 13C-NMR 进行测定。 1.4 结论 通过MS，1H-NMR, 13C-NMR进行测定，最后确定1为芳姜黄酮。MS测定，与谱库中的芳 姜黄酮数据匹配率为98% JH-NMR，13C-NMR测定结构正确，1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 1.17 (d, /= 7. 2 Hz, 3H), 1.78 (d, / = I. 2 Hz, 3H), 2.03 (d, J= 0.8 Hz, 3H), 2. 23(s, 3H), 2.50-2.56 (m, 1H), 2.61-2.66 (m, 1H) , 3.19-3.24 (m, 1H), 5.95 (t, /=1.2 Hz, 1H), 7. 03 (d, /=1.2 Hz, 4H) ; 13C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ ： 20. 72, 20.99, 22.00, 27.65, 35.30, 52.70, 124.11, 126.68, 129.12, 135.56, 143.71, 155.10，199.89。结果如图3、图4及图5所示。 2. 1高效液相色谱法-纯度检查 采用Agilent 1260型高效液相色谱仪（四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD紫外检测器、 ChemStation色谱工作站)，以汉邦公司Hedera C18 (4.6X200 mm, 5 μ m)色谱柱，柱温 25°C，流动相为甲醇-水（80:20)，DAD设定波长范围为190 ~400 nm，设定204、220、254、 280、310 nm五个检测波长，并同时观察其他波长的检测情况，以考察芳姜黄酮的纯度。 取芳姜黄酮适量，用甲醇制成每I mL含I mg的溶液，作为供试品溶液，取空白溶 齐U(甲醇）和供试品溶液各10 yL，分别注入液相色谱仪，结果扣除空白溶剂产生的色谱峰 后，芳姜黄酮的色谱峰面积归一化含量在各波长下均大于99%以上，见表1、图6及图7。 【权利要求】1. 一种，其特征在于：以姜黄挥发油为原 料，包括如下工艺步骤： (1)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种姜黄挥发油中芳姜黄酮对照品的制备方法，其特征在于：以姜黄挥发油为原料，包括如下工艺步骤：（1）加压正相硅胶柱粗分离：将原料与硅胶按1：10‑1：15的质量比，以体积比为30:1‑15:1的石油醚‑乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，加压柱层析，通过点薄层板，以石油醚‑乙酸乙酯展开，石油醚与乙酸乙酯的体积比为25:1‑15:1，在紫外下观察，收集极性相近的混合物，分离得到粗分离物；（2）加压正相硅胶柱细分离：将粗分离物加硅胶，首次加入的原料与细分离的硅胶的质量比为1:10‑1:15，以体积比为100:1‑50:1的石油醚‑乙酸乙酯为洗脱剂进行梯度洗脱，加压柱层析，通过点薄层板，以石油醚‑乙酸乙酯展开，石油醚与乙酸乙酯的体积比为25:1‑15:1，在紫外下观察，收集极性非常接近的混合物，分离得到细分离物；（3）制备高效液相色谱分离得到芳姜黄酮对照品：将细分离物中加入丙酮，细分离物与丙酮的体积比为1 ：5‑1:10，以甲醇和水为流动相，甲醇与水的体积为60：40‑90:10，流速为5‑10 mL/min，收集得到纯度为99%以上的芳姜黄酮纯品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周英，潘博文，石洋，王慧娟，崔凯，刘雄利，
申请(专利权)人：贵州大学，
类型：发明
国别省市：贵州;52