小反刍兽疫病毒卵黄抗体的制备方法技术

本发明专利技术提供一种小反刍兽疫病毒卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤：(1)取小反刍兽疫病毒制备小反刍兽疫病毒抗原，将抗原灭活后与弗氏佐剂混合，免疫接种产蛋母鸡，接种后收集鸡蛋4℃保存；(2)采用辛酸法提纯得到小反刍兽疫病毒卵黄抗体。采用本发明专利技术方法制备的小反刍兽疫病毒卵黄抗体具有效果明显、特异性高、治疗效果迅速、疗效确实、生产成本低等优点，可有效阻止小反刍兽疫病毒对机体的攻击，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供一种，包括如下步骤：(1)取小反刍兽疫病毒制备小反刍兽疫病毒抗原，将抗原灭活后与弗氏佐剂混合，免疫接种产蛋母鸡，接种后收集鸡蛋4℃保存；(2)采用辛酸法提纯得到小反刍兽疫病毒卵黄抗体。采用本专利技术方法制备的小反刍兽疫病毒卵黄抗体具有效果明显、特异性高、治疗效果迅速、疗效确实、生产成本低等优点，可有效阻止小反刍兽疫病毒对机体的攻击，具有良好的应用前景。【专利说明】
本专利技术属于兽用生物制品领域，具体地说，涉及一种小反刍兽疫病毒卵黄抗体的 制备方法。
技术介绍
小反合兽疫（Peste des Petits Ruminants，PPR)，是由小反合兽疫病毒（Peste des Petits Ruminants Virus，PPRV)引起的一种急性、烈性传染病，是FAO/OIE规定 的法定报告传染病，该病被认为是世界上十分重要的烈性传染病之一，属于副黏病毒科 (Paramyxoviriade)麻瘆病毒属（Morbollivirus)，主要感染山羊、绵羊和野生小反合动 物。该病以发热、口炎、腹泻为主要特征。1942年，世界上首次在西非的科特迪瓦报道发生 了小反刍兽疫。我国西藏自治区2007年首次报道小反刍兽疫疫情，随后在2008年、2010 年西藏地区又相继发生小反刍兽疫疫情，2013年12月在新疆伊犁、2014年2月内蒙古自治 区巴彦淖尔市相继报道小反刍兽疫疫情的发生。由于该病具有较强的传播性，因此加强对 PPR的病原学及分子生物学特性研宄和流行病学及诊断与防控研宄对我国而言具有重要的 现实意义。 目前主要采用疫苗免疫来预防这种疾病的发生。由于还没有针对病毒性疾病的特 效药物，因此在临床治疗上主要采取对症治疗和用抗生素类药物预防并发症的发生，治疗 效果不理想。因此，亟待开发一种针对小反刍兽疫病毒特异性好、治疗效果好且疗效迅速的 治疗制剂。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种。 为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种，包括 如下步骤： (1)取小反刍兽疫病毒制备小反刍兽疫病毒抗原，将抗原灭活后与弗氏佐剂混合， 免疫接种产蛋母鸡，接种后收集鸡蛋4°C保存； (2)采用辛酸法提纯得到小反刍兽疫病毒卵黄抗体，具体如下： ①称取0. 816g乙酸钠，量取0. 54mL冰醋酸和IOOmL蒸馏水，配制pH值4. 5的醋 酸盐缓冲液200mL ; ②取免疫后鸡蛋，分离出蛋黄液，取IOOmL蛋黄液，按蛋黄液：醋酸盐缓冲液= 1:2-3 (优选1:2)的体积比混匀； ③加入9-12mL (优选9mL)辛酸，摇匀后室温静置； ④3000r/min离心30min，收集上清液，用0. 45 μ m滤膜过滤，收集滤液，冻干即得 小反刍兽疫病毒卵黄抗体。 其中，制备小反刍兽疫病毒抗原的方法为：将小反刍兽疫病毒液接种在Vero (非 洲绿猴肾细胞）单层细胞上，置于37°C，CO2培养箱中培养，待75%细胞出现细胞病变时收 毒，-20?20°C反复冻融3次，然后4°C，3000rpm离心30min，除去细胞碎片，收集上清液， 密度梯度离心后用作小反刍兽疫病毒抗原。 灭活抗原的方法如下：将小反刍兽疫病毒抗原置于50°C水浴中60分钟。 前述的方法，步骤（1)中将灭活后的抗原与弗氏佐剂按1:1的体积比混合后，免疫 接种22周龄产蛋母鸡，初次免疫剂量为0. 3mg/只，于免疫后14d、22d改为不完全弗氏佐剂 进行2次加强免疫，免疫剂量分别为0. 6mg/只、I. 2mg/只；免疫后每日收集鸡蛋，测定鸡蛋 卵黄液中小反刍兽疫病毒特异抗体效价，收集抗体效价为1:128以上的卵黄液，用于制备 小反刍兽疫病毒卵黄抗体。 前述的方法，步骤（2)中冻干温度为-38°C至完全冻干，并于4°C贮存。 本专利技术中使用的小反刍兽疫病毒包括但不限于Nigeria 75/1株。 本专利技术还提供采用上述方法制备的小反刍兽疫病毒卵黄抗体。 采用本专利技术方法制备的小反刍兽疫病毒卵黄抗体具有效果明显、特异性高、治疗 效果迅速、疗效确实、生产成本低等优点，可有效阻止小反刍兽疫病毒对机体的攻击，具有 良好的应用前景。 【专利附图】【附图说明】 图1为本专利技术实施例1中采用Western-blot方法检测卵黄抗体反应原性的结果； 其中，A为本专利技术实施例1中制备的免疫PPRV的卵黄抗体，B为免疫前的卵黄抗体；M为蛋 白分子量标准，1为重组PPRV-N蛋白，2为pET-32a(+)空载体，3为重组PPRV-N蛋白，4为 pET-32a(+)空载体。 【具体实施方式】 以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。 以下实施例中使用的小反刍兽疫病毒为Nigeria 75/1株。 实施例1小反刍兽疫病毒卵黄抗体及其制备方法 1.免疫用疫苗的制备 I. 1小反刍兽疫病毒增殖及抗原的制备 将小反刍兽疫病毒液接种3瓶Vero细胞，每瓶细胞接种Iml病毒液，瓶底面 积25cm 2，盖好瓶盖，横卧瓶管轻轻转动，使病毒液与整个细胞单层充分接触，在37 °C 下吸附40min，其间每隔IOmin晃动I次，无需吸弃病毒液，直接加含2 %胎牛血清的 DMEM(Dulbecco;s Modified Eagle Medium)细胞维持培养液5ml，同时设立细胞对照，在 37°〇0)2培养箱中培养。24h后倒掉维持液进行换液。逐日观察细胞病变，若72h后感染细 胞病变不明显，则收获细胞悬液，在-20?20°C反复冻融3次后在4°C下3000rpm离心30min 取上清液继续在细胞上盲传，盲传至第二代出现细胞病变，待75%细胞出现细胞病变时收 毒，-20?20°C反复冻融3次，然后在4°C下，3000rpm离心30min，除去细胞碎片，收集上层 清液，密度梯度离心后用作抗原。将小反刍兽疫病毒抗原置于50°C水浴中60分钟灭活。 1. 2疫苗的制备 灭活后小反刍兽疫病毒抗原的毒价为Loxio6TCID5ci。与弗氏佐剂按l :l(v/v)充 分乳化后，取22周龄产蛋母鸡，经鸡双翼、胸、腹部和背部皮下多点注射；初次免疫剂量为 0. 3mg/只，于免疫后的14d、22d后改为不完全弗氏佐剂进行2次加强免疫，免疫剂量分别为 0. 6mg/只、1.2mg/只；免疫后每日收集鸡蛋，编号后于4°C保存。 2.卵黄抗体制备 2. 1卵黄的收获及灭活 2免后1周开始收集经抽检合格的免疫鸡蛋，将蛋壳消毒，米取手工或机械打蛋。 充分除去蛋清（白）、胚盘和系带，收集卵黄。充分搅拌使卵黄呈均匀膏状，加入等体积经 121°C 30min灭菌并冷却的蒸馏水，搅拌混匀，62. 5°C加热灭活30min。 2. 2抗体的辛酸法提纯 取免疫后鸡蛋，分离出卵黄液，取IOOmL卵黄液，按卵黄液：缓冲液=1:2的体积比 混合，充分混匀。加入9mL的辛酸（加入辛酸的量为卵黄液和缓冲液总量的3% )，摇匀后 室温静置。3000r/min离心30min，收集上清液，用0. 45 μ m滤膜本文档来自技高网...

【技术保护点】
小反刍兽疫病毒卵黄抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取小反刍兽疫病毒制备小反刍兽疫病毒抗原，将抗原灭活后与弗氏佐剂混合，免疫接种产蛋母鸡，接种后收集鸡蛋4℃保存；(2)采用辛酸法提纯得到小反刍兽疫病毒卵黄抗体，具体如下：①称取0.816g乙酸钠，量取0.54mL冰醋酸和100mL蒸馏水，配制pH值4.5的醋酸盐缓冲液200mL；②取免疫后鸡蛋，分离出蛋黄液，取100mL蛋黄液，按蛋黄液：醋酸盐缓冲液＝1:2‑3的体积比混匀；③加入9‑12mL辛酸，摇匀后室温静置；④3000r/min离心30min，收集上清液，用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，冻干即得小反刍兽疫病毒卵黄抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李刚，隋修锟，李铁，梁琳，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，合肥中大生物技术发展有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11