一株耐苦参碱根瘤菌株及其应用和以其制备的抗污染根瘤菌剂制造技术

本发明专利技术公开了一株耐苦参碱根瘤菌株，并公开了其在降低根瘤菌剂污染率及提高占瘤率中的应用，此作用是通过将耐苦参碱根瘤菌株发酵培养后的菌液，与苦参碱抑菌液混合制备得到抗污染根瘤菌剂来实现的。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术提供的抗污染根瘤菌剂具有以下优点：对环境友好；可有效增强菌剂抗污染效果；可保持较高活菌数；施用后可抑制土著根瘤菌结瘤，提高目标根瘤菌占瘤率；抑制土壤环境中的病原菌，减少农药使用量；降低菌剂生产过程中对无菌环境的要求，降低制备成本；方法简便，易于推广。

【技术实现步骤摘要】
一株耐苦参碱根瘤菌株及其应用和以其制备的抗污染根瘤菌剂
本专利技术涉及农业菌剂领域，具体涉及一株耐苦参碱根瘤菌株及其应用和以其制备的抗污染根瘤菌剂。
技术介绍
根瘤菌与豆科植物间的共生固氮对农业生产至关重要，农业上常通过为豆科植物接种优良根瘤菌来促进作物生长和增加种子产量，这也是环境友好型农业发展的主要趋势，并具有重大经济意义。据统计，植物施用菌肥后，产量可增幅10-30％不等，对新垦或低产田的增产效果更高达71.2-241％。根瘤菌剂的施用可有效避免因氮肥施用过多而导致的硝酸盐淋溶作用，并有效避免化学氮肥生产过程中的高能量消耗，在植物养分供给及环境保护中的作用不可小觑。然而，商用根瘤菌剂在实际施用过程中常面临着贮藏期短、污染率高、有效活菌数低以及施用后竞争结瘤效果不理想等诸多现实问题。贮藏时间是衡量菌剂质量的主要指标之一，而污染率则是菌剂贮藏期限的主要影响因素之一。Olsen等对北美根瘤菌剂市场的调查发现，超过25％的产品中含有病原菌或其它抑制根瘤菌生长的微生物，而在阿根廷，Gomes等(1997)在对根瘤菌剂的调查中也得到了同样的结论，为获得更好的根瘤菌接种效果，抗污染菌剂的制备势在必行。即使是贮藏效果良好的根瘤菌剂，在施用到实际的田间环境中后，也并不一定可以成功的与豆科作物共生结瘤。新施用的优良根瘤菌不仅需要面对来自土壤的各种环境条件胁迫，如高土壤含氮量、土壤理化性状的限制以及气候因素等，还需与固氮效率低下、与当地自然环境适应良好的土著根瘤菌进行结瘤竞争。此外，很多土壤微生物与根瘤菌间呈拮抗关系，这其中包括掠食性的无脊椎原生动物类、粘细菌、弧菌和噬菌体，以及其它一些可以产生次生代谢物质或通过改变环境因素而对根瘤菌起抑制作用的微生物。所有这些不利因素都将影响根瘤菌与宿主植株的共生结瘤效果。因此，菌种间的竞争相当重要，这就要求目标菌株具有相对持久的竞争能力。为获得出色的结瘤效果，所接种根瘤菌必须在高效固氮的同时，竞争结瘤能力超过土著根瘤菌及其它阻碍性的微生物，形成更多根瘤。Jung和Sessitsch等研究发现通过向微生物菌剂中添加抑菌剂类物质可以减少菌剂污染率并增加目标菌株的竞争效果。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，通过筛选耐植物源抑菌剂—苦参碱的高效固氮根瘤菌株，提供了含有一定浓度苦参碱抑菌剂的高竞争型抗污染根瘤菌剂，可有效解决根瘤菌剂在贮藏期间的高污染率以及施用后的低占瘤率问题，同时，还可有效降低根瘤菌剂的贮藏及运输成本。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为：一株耐苦参碱根瘤菌株，所述耐苦参碱根瘤菌株为草木犀剑菌(Ensfermeliloti)LH3436，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.9296，保藏日为2014年6月12日。耐苦参碱根瘤菌株的筛选方法为：将紫花苜蓿根瘤中分离的高效固氮根瘤菌点接于含有600mg/L浓度苦参碱抑菌剂的平板中，观察其生长情况，并结合含苦参碱平板培养基对空气和土壤源杂菌的抑制效果，筛选对苦参碱具有较好抗性的耐药菌株，进行传代试验后，选择耐药特性稳定的菌株用作生产菌株。本专利技术的第二个目的是提供了上述的一株耐苦参碱根瘤菌株在降低根瘤菌剂污染率及提高占瘤率中的应用。进一步的，上述的应用，是将耐苦参碱根瘤菌株发酵培养后的菌液，与苦参碱抑菌液混合制备得到抗污染根瘤菌剂。本专利技术的第三个目的是提供了一种抗污染根瘤菌剂，是将上述的耐苦参碱根瘤菌株发酵培养后的菌液与苦参碱抑菌液混合制备得到的。本专利技术的第四个目的是提供了一种抗污染根瘤菌剂，是将上述的耐苦参碱根瘤菌株发酵培养后的菌液加入至苦参碱抑菌液后，再与过筛灭菌基质混合后制备得到的。进一步的，上述的一种抗污染根瘤菌剂，所述抗污染根瘤菌剂中，苦参碱抑菌剂的终浓度为600mg/L。苦参碱购自宝鸡方晟生物开发有限公司。进一步的，上述的一种抗污染根瘤菌剂，是将上述的耐苦参碱根瘤菌株，培养至对数期，即OD600nm为0.5-0.8时的根瘤菌液0.2mL接入至通用YMA液体培养基中，并于28℃下120r/min发酵培养，待活菌数达到1010cfu/ml时，再加入经0.22μm滤膜过滤灭菌后的苦参碱抑菌剂，搅拌均匀并使苦参碱抑菌剂的终浓度达到600mg/L。进一步的，上述的一种抗污染根瘤菌剂，所述过筛灭菌基质为泥炭和蛭石的混合物，使用粉碎机将基质原料粉碎，过0.15mm筛，泥炭使用前以磨细的CaCO3将其pH值调至7.0，蛭石以HCl调节pH值至7.0，再将泥炭、蛭石混合物基质置于烘箱中100℃烘干，之后以聚丙烯袋双层密封后，121℃下高温灭菌3h，取出冷却并放置2-3d后，待基质内耐热芽孢杆菌停止休眠时，重复进行灭菌，连续3次，将彻底灭菌的基质置于无菌条件下保存备用，用量均为5g/袋。抗污染根瘤菌剂需置于4℃下冷藏保存。本专利技术的有益效果为：1、环境友好型抑菌剂：将植物源类活性抑菌物质苦参碱添加到根瘤菌剂中，具有对病原菌及其它微生物较强的特异性作用，不易引起抗药性，易降解，对人畜低毒，不污染环境等优点，可有效避免各种化学类抑菌剂残留期长、不易降解的缺点，以及部分抗生素类药物所导致的微生物形态和毒性变化以及基因突变能力的改变等问题；2、可有效增强菌剂抗污染效果：在菌剂中添加对空气和土壤源杂菌具有广谱抑制效果的苦参碱抑菌剂，使得实际贮藏过程中入侵的少量杂菌由于抑菌剂的存在而无法存活或难以大量繁殖，实际降低了菌剂的污染几率。所制备的含抑菌剂的固体菌剂在贮藏150d后，其杂菌数为0.20×109cfu/g，与普通菌剂的杂菌数2.65×109cfu/g相比，杂菌数降低了13.25倍，可有效抗污染；根据各含苦参碱平板中培养136h时的数据显示，600mg/L的苦参碱抑菌剂可有效抑制98.97％的空气源杂菌及98.69％的土壤源杂菌。将所制备的含苦参碱液体菌剂在进入对数期时进行暴露空气和添加土壤溶液处理后，继续培养1-2d后观察其污染率，发现与对照菌剂比，暴露空气处理的杂菌率由对照的30.62％降至添加抑菌剂处理的17.71％；而添加土壤溶液处理的杂菌率由对照的52.84％降至添加抑菌剂处理的26.93％。将含苦参碱液体菌剂加入泥炭后制备固体菌剂，于室温下通风处贮藏，贮藏150d时，污染率降低至对照的7.16％；3、可保持较高活菌数：贮藏150d的固体菌剂活菌数为0.81×109cfu/g，为普通菌剂活菌数(0.76×109cfu/g)的106.58％；4、施用后可抑制土著根瘤菌，提高目标根瘤菌占瘤率：直接将含有相应浓度抑菌剂的YMA液体培养基接入耐苦参碱根瘤菌发酵至对数期后，接种于寄主植株，由于耐药菌株在发酵过程中消耗了部分抑菌剂毒性，使得实际施用的抑菌剂浓度低于最初的添加浓度，但仍可显著抑制环境中土著菌的活性，为目标根瘤菌的浸染结瘤创造有利环境，进而增加目标根瘤菌的竞争结瘤效果。接种了添加液体抑菌剂植株的占瘤率为79％，接种对照(普通菌剂)占瘤率为71％，占瘤率高于普通菌剂11.3％。5、抑制土壤环境中的病原菌，减少农药使用量：苦参碱主要以其所含的生物碱类物质，通过毒杀、忌避、拒食、麻醉和抑制生长发育等方式达到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株耐苦参碱根瘤菌株，其特征在于，所述耐苦参碱根瘤菌株为草木犀剑菌Ensfer meliloti，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9296，保藏日为2014年6月12日。

【技术特征摘要】
1.一株耐苦参碱根瘤菌株，其特征在于，所述耐苦参碱根瘤菌株为草木犀剑菌（Ensfermeliloti）LH3436，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.9296，保藏日为2014年6月12日。2.如权利要求1所述的一株耐苦参碱根瘤菌株在降低根瘤菌剂污染率及提高占瘤率中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是将耐苦参碱根瘤菌株发酵培养后的菌液，与苦参碱抑菌液混合制备得到抗污染根瘤菌剂。4.一种抗污染根瘤菌剂，其特征在于，是将如权利要求1所述的耐苦参碱根瘤菌株发酵培养后的菌液与苦参碱抑菌液混合制备得到的。5.一种抗污染根瘤菌剂，其特征在于，是将如权利要求1所述的耐苦参碱根瘤菌株发酵培养后的菌液加入至苦参碱抑菌液后，再与过筛灭菌基质混合后制备得到的。6.根据权利要求4或5所述的一种抗污染根瘤菌剂，其特征在于，所述抗污染根瘤菌剂中，苦参碱抑菌剂的终浓度为600mg/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：师尚礼，霍平慧，李剑峰，曹文侠，祁娟，苗阳阳，
申请(专利权)人：甘肃农业大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62