用于检测多特异性结合物的方法技术

本文中报道了一种用于检测样品中多特异性抗体的方法，其中i)与多特异性抗体的第一结合特异性结合的第一抗独特型抗体和ii)与多特异性抗体的第二结合特异性结合的第二抗独特型抗体特异结合多特异性抗体，并且确定形成的复合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及一种用于检测样品中的多特异性结合物的方法，其中使用针对该多特异性结合物的不同结合特异性的抗独特型抗体，检测该多特异性结合物。专利技术背景使用抗体的标准固相免疫测定法涉及在固相上吸附/固定的抗体(捕捉抗体)、抗原和针对与酶或可检测标记物(示踪抗体)缀合的抗原的另一个表位的抗体之间形成复合物。在该测定法中，形成夹心物(sandwich)：固相/捕捉抗体/抗原/示踪抗体。在夹心物等催化的反应中，抗体缀合的酶的活性与温育介质中的抗原浓度成比例。抗独特型抗体测定法在例如US 5,219,730；WO 87/002778；EP 0 139 389和EP 0 170 302中提及。Wadhwa,M.等人(J.Immunol.Methods 278(2003)1-17)报道了用于检测、测量和表征由治疗性生物制品诱导的不想要的抗体的对策。EP 1 917 854中报道了用于产生抗独特型抗体的方法。在WO 2008/119353中报道了双特异性抗体和用于产生它的方法。用于确定蛋白质和抗体治疗药的二价的方法在WO 2006/096697中报道。在WO 2008/134046中报道了强力、稳定和无免疫抑制的抗CD4抗体。Muller,K.M.等人报道了抗体的第一恒定域(CH1和CL)可以用作双特异性微型抗体的异二聚化结构域。专利技术概述已经发现在用于确定样品中多特异性抗体的量的夹心免疫测定法中，通过使用两种抗独特型抗体作为捕捉抗体和作为示踪抗体，其中每种抗独特型抗体与多特异性抗体的不同结合特异性结合，可以最小化因样品基质(例如血清或人血浆，抗原等)所致的影响。额外地，可以使用这样的测试设置，所述测试设置更灵敏，更不受样品基质影响、可以更快地进行，需要样品基质的最小移除/稀释并分别提供捕捉抗体和/或示踪抗体标记/衍生化/固定的更大灵活性。这通过使用两种抗独特型抗体实现，一种针对双特异性抗体的第一结合特异性并且一种针对双特异性抗体的第二结合特异性。因此，本文中报道了一种用于(免疫)确定样品中多特异性结合物的量的方法，包括步骤：－通过将复合物同与多特异性结合物的第二结合特异性特异结合的抗独特型抗体温育确定复合物的量，其中所述复合物是在i)与多特异性结合物的第一结合特异性特异结合的抗独特型抗体，和ii)多特异性结合物之间形成的复合物，所述第二结合特异性与多特异性抗体的第一结合特异性不同，并且因而确定多特异性结合物在样品中的量。在一个实施方案中，与多特异性结合物的第一结合特异性特异结合的抗独特型抗体与固相缀合。在一个实施方案中，与多特异性结合物的第二结合特异性特异结合的抗独特型抗体与可检测标记物缀合。在一个实施方案中，样品包含(人)血清或(人)血浆，和/或是细胞裂解物，和/或包含多特异性结合物的一种或多种抗原。在一个实施方案中，样品是(人)血清或(人)血浆。在一个实施方案中，多特异性结合物选自抗体、包含抗体或抗体片段和非抗体多肽的融合多肽、包含抗体或抗体片段和可溶性受体的融合多肽，或者包含抗体或抗体片段和肽结合分子的融合多肽。在一个实施方案中，多特异性结合物是抗体。在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体、或三特异性抗体、或四特异性抗体、或五特异性抗体、或六特异性抗体。在一个实施方案中，抗体是双特异性抗体。在一个实施方案中，结合特异性是结合位点或成对的抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域。在一个实施方案中，与多特异性结合物的第一结合特异性特异结合的抗独特型抗体是生物素酰化的并且固相经链霉亲和素包被。在一个实施方案中，固相是链霉亲和素包被的顺磁珠或链霉亲和素包被的琼脂糖珠。在一个实施方案中，与多特异性结合物的第二结合特异性特异性结合的抗独特型抗体是洋地黄毒苷化的(digoxigenylated)。在一个实施方案中，该方法包括步骤：－通过确定形成的复合物中的可检测标记物来确定复合物的量，其中所述复合物是在i)与多特异性结合物的第一结合特异性特异结合的抗独特型抗体，ii)多特异性结合物，和iii)与多特异性结合物的第二结合特异性特异结合并包含可检测标记物的抗独特型抗体之间形成的复合物。在一个实施方案中，通过借助N端氨基和/或ε-氨基(赖氨酸)、不同赖氨酸的ε-氨基、药物抗体的氨基酸主链的羧基、巯基、羟基和/或酚官能团和/或药物抗体的糖结构的糖醇基化学结合，实施抗独特型抗体与其缀合配偶体的缀合。在一个实施方案中，抗独特型抗体是这样的混合物，其包含通过至少两种不同氨基与固相缀合的抗独特型抗体。这类通过不同氨基的偶联可以通过如下实施，在第一步中用化学保护剂酰化(例如通过柠康酰化(citraconylation))ε-氨基的一部分。在第二步中，通过剩余的氨基实施缀合。随后，移除柠康酰化，并且将抗体通过剩余的游离氨基与固相缀合，即，将获得的抗体通过未受柠康酰化保护的氨基与固相缀合。合适的化学保护剂在未保护的侧链胺上形成键，比N末端处的那些键更不稳定且不同。许多这类化学保护剂是已知的(参见例如EP 0 651 761)。在一个实施方案中，化学保护剂包括环状二羧酸酐，例如马来酸酐或柠康酸酐(citraconylic acid anhydride)。在一个实施方案中，抗独特型抗体通过被动吸附与固相缀合。被动吸附例如由Butler,J.E.在“Solid Phases in Immunoassay”(1996)205-225和Diamandis,E.P.和Christopoulos,T.K.(编者)在“Immunoassay”(1996)Academic Press(San Diego)中描述。在一个实施方案中，抗独特型抗体通过特异性结合对缀合(固定)。在一个实施方案中，这种结合对(第一组分/第二组分)选自链霉亲和素或亲和素蛋白/生物素、抗体/抗原(参见例如，Hermanson,G.T.等人，Bioconjugate Techniques,Academic Press(1996)、凝集素/多糖、类固醇/类固醇结合蛋白、激素/激素受体、酶/底物、IgG/蛋白A和/或蛋白G等。在一个实施方案中，抗独特型抗体与生物素缀合，并且通过固定的亲和素或链霉亲和素实施固定。附图描述图1用于确定血清样品和细胞样品中双特异性抗体浓度的示意性药物代谢动力学ELISA测定原理(基于抗独特型抗体的ELISA)。图2用于检测抗VEGF/ANG2抗体的基于抗原本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于确定样品中多特异性抗体的量的方法，包括步骤：－通过将复合物同与多特异性抗体的第二结合特异性特异结合的抗独特型抗体温育，确定复合物的量，其中所述复合物是在i)与多特异性抗体的第一结合特异性特异结合的抗独特型抗体和ii)多特异性抗体之间形成的复合物，所述多特异性抗体的第二结合特异性不同于多特异性抗体的第一结合特异性，和由此确定样品中多特异性抗体的量。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.07.13 EP 12176342.91.用于确定样品中多特异性抗体的量的方法，包括步骤：
－通过将复合物同与多特异性抗体的第二结合特异性特异结合的抗独特
型抗体温育，确定复合物的量，其中所述复合物是在i)与多特异性抗体的第一
结合特异性特异结合的抗独特型抗体和ii)多特异性抗体之间形成的复合物，所
述多特异性抗体的第二结合特异性不同于多特异性抗体的第一结合特异性，和
由此确定样品中多特异性抗体的量。
2.根据权利要求1所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：KG·施图本拉赫，M·扎德克，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH