功能化淫羊藿苷衍生物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术所述功能化淫羊藿苷衍生物，为丁二酸化淫羊藿苷和马来酸化淫羊藿苷，丁二酸化淫羊藿苷的结构式：马来酸化淫羊藿苷的结构式：制备方法：以淫羊藿苷和酸酐为原料，淫羊藿苷与酸酐的摩尔比为1：(2～11)；将淫羊藿苷和酸酐分别溶解于极性溶剂中形成溶液，在搅拌下将两种溶液混合均匀，然后在25℃～40℃反应4～24小时，反应结束后除去极性溶剂和残留酸酐及其分解产物得反应产物，将反应产物冷冻干燥得到功能化淫羊藿苷衍生物。本发明专利技术所述功能化淫羊藿苷衍生物水溶性好、细胞毒性低，通过其可将Ica以共价形式载入到组织工程支架材料中，且所述功能化淫羊藿苷衍生物能作为生物活性物质在组织工程中应用。

【技术实现步骤摘要】
功能化淫羊藿苷衍生物及其制备方法与应用
本专利技术属于生物医学材料领域，涉及淫羊藿苷衍生物及其制备方法，以及淫羊藿苷衍生物在组织工程中的应用。
技术介绍
组织工程是目前最具前景的缺损组织修复与功能重建技术，人工组织或前组织由以生物材料制备的支架和种子细胞构成，前者为后者提供粘附、增殖、分化和组织化的支撑环境，最终共同形成具有一定形状和功能的人工组织或前组织。但仅将种子细胞和支架复合，细胞生长缺乏有效调控，最终很难形成需要的目标组织，其主要原因在于支架材料本身对细胞分化和合成代谢的促进作用有限，而组织的形成需要有大量细胞因子参与。为此，有较多研究尝试将相关生长因子载入支架，通过其释放来调节种子细胞的分化和细胞外基质代谢，以期获得需要的组织。然而，载入生长因子虽可促进细胞增殖和分化，但组织形成的不同阶段所需生长因子的种类和浓度有所不同，同时，外源性生长因子存在价格昂贵、易降解失活、可能具有免疫原性，以及可能引入意想不到的外源性基因等诸多问题。淫羊藿苷(icariin，简称Ica)是从药用植物淫羊藿(HerbEpimedii，简称HEP)中分离的一种性质较为稳定的黄酮，是HEP的主要活性成分。鉴于Ica的多种生物活性，将Ica装载到组织工程支架中，可提高支架材料的生物学功能。然而，当Ica的浓度大于1×10-5M时具有明显的细胞毒性，尽管Ica的溶解度较低，但在常温下获得的饱和溶液其浓度也达到2×10-5M，对细胞的生长有明显的抑制作用。为了提高Ica的生物利用度，避免非共价的载入方式存在的初始暴释以及载入量有限等问题，需要将Ica共价引入组织工程支架中，但Ica化学性质相对稳定，没有易于发生反应的活性基团，难以与其它物质以共价的形式反应结合，只能以非共价形式载入到支架材料中。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供水溶性好、细胞毒性低的功能化淫羊藿苷衍生物及其制备方法，通过功能化淫羊藿苷衍生物可将Ica以共价形式载入到组织工程支架材料中。本专利技术的再一目的是提供淫羊藿苷衍生物作为生物活性物质在组织工程中的应用。本专利技术所述功能化淫羊藿苷衍生物，为丁二酸化淫羊藿苷(简称Ica-SA)、马来酸化淫羊藿苷(简称Ica-MAL)。丁二酸化淫羊藿苷的结构式如下：马来酸化淫羊藿苷的结构式如下：上述结构式中，丁二酸残基或马来酸残基与淫羊藿苷分子结构式中的葡萄糖环和/或鼠李糖环上的任意一个或多个羟基相连，或与淫羊藿苷分子结构式中C5位的酚羟基相连。上述功能化淫羊藿苷衍生物，所述丁二酸残基与淫羊藿苷分子的摩尔比为(2.8～1.1):1。上述功能化淫羊藿苷衍生物，所述马来酸残基与淫羊藿苷分子的摩尔比为(2.7～1.4):1。本专利技术所述功能化淫羊藿苷衍生物的制备方法，工艺步骤如下：以淫羊藿苷和酸酐为原料，淫羊藿苷与酸酐的摩尔比为1：(2～11)；将淫羊藿苷和酸酐分别溶解于极性溶剂中形成淫羊藿苷溶液和酸酐溶液，在搅拌下将酸酐溶液与淫羊藿苷溶液混合均匀，然后在25℃～40℃反应4小时～24小时，反应结束后除去极性溶剂和残留酸酐及其分解产物得反应产物，将反应产物冷冻干燥得到功能化淫羊藿苷衍生物；所述溶解淫羊藿苷和溶解酸酐的极性溶剂体积相等，且溶解淫羊藿苷和溶解酸酐的极性溶剂的体积之和与淫羊藿苷的质量之比为1：(10～50)，极性溶剂的体积的单位为L，淫羊藿苷的质量单位为g。上述方法中，所述酸酐为丁二酸酐或马来酸酐。上述方法中，所述的极性溶剂为吡啶、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、四氢呋喃中的任一种。上述方法中，反应结束后除去极性溶剂和残留酸酐及其分解产物的操作有以下两种：1、第一种的操作步骤依次如下：(1)通过减压蒸馏或自然挥发除去反应液中大部分极性溶剂，得膏状物；(2)将所得膏状物用有机萃取剂溶解后加入去离子水搅拌洗涤，然后静置分层并分离出水层得含产物的有机层，所述有机萃取剂的体积与淫羊藿苷的质量之比为1:(2～10)，有机萃取剂体积的单位为L，淫羊藿苷质量的单位为g；(3)将含产物的有机层加入去离子水搅拌洗涤后静置分层并分离出水层，对所得含产物的有机层重复上述操作，直至分离出的水层达到中性；(4)通过减压蒸馏或自然挥发除去有机层中的有机萃取剂得产物。上述操作中，所述有机萃取剂为乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸异戊酯中的任一种。2、第二种的操作第二种的操作是将所得反应液转移到透析袋中，用去离子水进行透析，所述透析袋的截流分子量为500道尔顿～800道尔顿。实验表明：本专利技术所述功能化淫羊藿苷衍生物具有良好的水溶性，与淫羊藿苷化合物相比，细胞毒性明显降低，即使在高浓度下，也没有表现出明显的毒副作用(见实施例8)；将本专利技术所述功能化淫羊藿苷衍生物加入支架材料中，可使淫羊藿苷以共价形式与支架材料结合，减缓淫羊藿苷的释放速率(见实施例9)；将本专利技术所述功能化淫羊藿苷衍生物的支架材料用于软骨细胞培养，能够保持软骨细胞表型，形成大量的细胞簇(见实施例10)。因此，本专利技术所述功能化淫羊藿苷衍生物可作为调节种子细胞分化和细胞外基质代谢的生物活性物质在组织工程中应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：1、本专利技术将羧基，或羧基和双键活性基团引入到淫羊藿苷分子中形成了新型的功能化淫羊藿苷衍生物，增加了淫羊藿苷衍生物的类型。2、由于本专利技术所述功能化淫羊藿苷衍生物含有亲水性基团——羧基，与淫羊藿苷相比，水溶性更好，细胞毒性更低，在高浓度下没有表现出对细胞的明显毒性。3、由于本专利技术所述功能化淫羊藿苷衍生物含有羧基，或含有羧基和双键活性基团，因而提供了淫羊藿苷分子与支架材料化学接枝的位点，使得淫羊藿苷能够以共价的形式载入组织工程支架材料中，有利于其在体内的持续作用，提高了淫羊藿苷的生物利用度；同时，由于引入的羧基和/或双键基团与淫羊藿苷的结合位点主要是在其糖环上，不会改变药物本身的药理活性，在体内环境中，随着支架材料的降解以及酸酐与Ica之间形成的化学键的断裂会持续释放出药物分子并发挥其药理活性，拓宽了淫羊藿苷在生物医学工程领域的应用。4、加入本专利技术所述功能化淫羊藿苷衍生物的支架材料用于细胞培养，具有促进种子细胞分化和基质合成代谢的功能，且性质稳定。5、本专利技术所述功能化淫羊藿苷衍生物与现有载入支架的外源性生长因子相比，价格低廉，有利于推广使用。6、本专利技术所述方法工艺简单，原料易于获取，所用设备为常规设备，因而有利于工业化生产。附图说明图1为淫羊藿苷(Ica)及其功能化衍生物的1H-NMR图谱，其中，图(a)为Ica的1H-NMR图谱；图(b)为Ica-SA的1H-NMR图谱，图(c)为Ica-MAL的1H-NMR图谱。图2为不同浓度的淫羊藿苷(Ica)及其功能化衍生物作用于3T3细胞48小时后的细胞活性对比图。图3为淫羊藿苷(Ica)及其功能化衍生物作用于3T3细胞48小时后的激光共聚焦照片(左)和显微镜照片(右)(A图为Ica，B图为Ica-SA，C图为Ica-MAL，摩尔浓度均为4×10-4M，D图为空白对照)。图4为水凝胶支架在PBS溶液中浸泡14天后经AlCl3溶液染色后的照片(从左至右依次为HA水凝胶支架照片，HA/Ica-MAL水凝胶支架照片，HA/Ica水凝胶支架照片)。图5为包裹在水凝胶支架中的兔软骨细胞体外培养9天后的激本文档来自技高网...

【技术保护点】
功能化淫羊藿苷衍生物，其特征在于结构式如下：其中，丁二酸残基或马来酸残基与淫羊藿苷分子结构式中的葡萄糖环和/或鼠李糖环上的任意一个或多个羟基相连，或与淫羊藿苷分子结构式中C5位的酚羟基相连。

【技术特征摘要】
1.功能化淫羊藿苷衍生物，其特征在于结构式如下：其中，丁二酸残基或马来酸残基与淫羊藿苷分子结构式中的葡萄糖环和/或鼠李糖环上的任意一个或多个羟基相连，或与淫羊藿苷分子结构式中C5位的酚羟基相连，所述丁二酸残基与淫羊藿苷分子的摩尔比为(2.8～1.1):1，所述马来酸残基与淫羊藿苷分子的摩尔比为(2.7～1.4):1。2.权利要求1所述功能化淫羊藿苷衍生物的制备方法，其特征在于：以淫羊藿苷和酸酐为原料，淫羊藿苷与酸酐的摩尔比为1：(2～11)；将淫羊藿苷和酸酐分别溶解于极性溶剂中形成淫羊藿苷溶液和酸酐溶液，在搅拌下将酸酐溶液与淫羊藿苷溶液混合均匀，然后在25℃～40℃反应4小时～24小时，反应结束后除去极性溶剂和残留酸酐及其分解产物得反应产物，将反应产物冷冻干燥得到功能化淫羊藿苷衍生物；所述酸酐为丁二酸酐或马来酸酐；所述溶解淫羊藿苷和溶解酸酐的极性溶剂体积相等，且溶解淫羊藿苷和溶解酸酐的极性溶剂的体积之和与淫羊藿苷的质量之比为1：(10～50)，极性溶剂的体积的单位为L，淫羊藿苷的质量单位为g。3.根据权利要求2所述功能化淫羊藿苷衍生物的制备方法，其特征在于所述的极性溶剂为吡啶、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、四氢呋喃中...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖玉梅，何龙，杨继榕，鲁建，李东晓，张兴栋，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51