一种筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂高通量筛选方法技术

本发明专利技术发现了一种筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂高通量筛选方法，本发明专利技术中利用乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶作用下水解成胆碱，再经过胆碱氧化酶的作用生成过氧化氢，生成的过氧化氢与Amplex Red reagent在辣根过氧化酶作用下会产生带有荧光的产物试卤灵，通过荧光强弱来判断乙酰胆碱酯酶作用，从而得出化合物是否有乙酰胆碱酯酶抑制作用。包括以下步骤：(1)乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选模型的建立与优化：确定乙酰胆碱和乙酰胆碱酯酶反应的最适浓度；(2)阳性药验证模型可靠性：阳性药IC50与参考文献一致。方法简便快捷；荧光检测值灵敏度高，提高检测精确度；结果稳定可靠，重现性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于药理学领域，利用荧光检测技术，构建了乙酰胆碱酯酶抑制剂的高通量筛选模型，用于待测样品对乙酰胆碱酯酶抑制活性的高通量检测。
技术介绍
乙酰胆碱酯酶抑制剂，与乙酰胆碱(ACh)一样，也能与胆碱酯酶(AChE)结合，但是结合比较牢固，水解较慢，使AChE不能再与ACh结合，从而导致胆碱能神经末梢释放的ACh不能及时被AChE分解，造成堆积，产生拟胆碱作用。乙酰胆碱酯酶抑制剂在临床上用于治疗重症肌无力、术后肠胀气，及眼科用药。因此筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂在临床上有一定意义。实验中利用乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶作用下水解成胆碱，再经过胆碱氧化酶的作用生成过氧化氢，生成的过氧化氢与Amplex Red reagent在辣根过氧化酶作用下会产生带有荧光的产物试卤灵，通过荧光强弱来判断乙酰胆碱酯酶作用，从而得出化合物是否有乙酰胆碱酯酶抑制作用。目前，已有多种乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选方法，多利用吸光度来筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂，但是此方法费时费力，难以做到高通量筛选。因此，建立方便快捷准确的检测方法，特别是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立一种基于荧光的乙酰胆碱酯酶抑制剂高通量筛选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。本专利技术的技术方案：采用荧光方法建立体外乙酰胆碱酯酶抑制剂高通量筛选模型，初筛，复筛发现一类具有抑制乙酰胆碱酯酶活性的候选化合物。具体步骤如下：本专利技术利用荧光的方法建立了一种乙酰胆碱酯酶抑制剂高通量筛选模型。步骤一：乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选模型的建立与优化。步骤二：阳性药验证模型可靠性。步骤三：高通量筛选模型验证。附图说明：图1：乙酰胆碱浓度梯度优化实验结果。图2：乙酰胆碱酯酶浓度梯度优化实验结果。图3：阳性药他克林对乙酰胆碱酯酶的抑制曲线图。图4：高通量筛选Z′值分布。具体实施方式以下结合附图说明本专利技术的具体实施方式：一、乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选方法建立1、实验材料Amplex Red reagent(Invitrogen，USA)、DMSO(Invitrogen，USA)、辣根过氧化酶(Invitrogen，USA)、过氧化氢(Invitrogen，USA)、5×反应buffer(Invitrogen，USA)、胆碱氧化酶(Invitrogen，USA)、氯化乙酰胆碱(Invitrogen，USA)、乙酰胆碱酯酶(Invitrogen，USA)、384孔聚丙烯微孔板Cat#3573(Coming，USA)、一次性枪头(Axygen，USA)2、实验步骤(1)乙酰胆碱最适浓度确定1)配制不同浓度的乙酰胆碱，每孔加入20μl。2)每孔加入20μl1×反应buffer。3)配制给定浓度的Amplex Red reagent、辣根过氧化酶、胆碱氧化酶、乙酰胆碱酯酶，等体积混合，每孔加入40μl。4)室温反应1h。5)检测荧光强度，确定最适乙酰胆碱浓度(见图1)。(2)乙酰胆碱酯酶最适浓度确定1)配制不同浓度的乙酰胆碱酯酶，每孔加入20μl。2)每孔加入20μl1×反应buffer。3)配制给定浓度的Amplex Red reagent、辣根过氧化酶、胆碱氧化酶、乙酰胆碱，等体积混合，每孔加入40μl。4)室温反应1h。5)检测荧光强度，确定最适乙酰胆碱酯酶浓度(见图2)。(3)阳性药(他克林)IC501)配制不同浓度的他克林，每孔加入20μl。2)配制最适浓度的乙酰胆碱，每孔加入20μl(空白对照加20μl1×反应buffer)3)配制给定浓度的Amplex Red reagent、辣根过氧化酶、胆碱氧化酶以及最适浓度的乙酰胆碱酯酶，等体积混合，每孔加入40μl。4)室温反应1h。5)检测荧光强度，计算得出他克林的IC50(见图3)。二、数据处理(1)根据公式计算各孔的相对抑制率(2)活性样品进行浓度稀释后检测的相对抑制率值，使用作Graphpad软件作图求算半数抑制率IC50。实验结果乙酰胆碱酯酶筛选模型优化结果：最佳反应所需的确定乙酰胆碱的最适浓度是50μM(见图1)，乙酰胆碱酯酶的最适浓度是200mU/ml(见图2)，阳性药抑制率IC50为0.7为μM(见图3)，并通过信噪比和Z’值(见图4)验证表明采用本方法建立的乙酰胆碱酯酶抑制剂体外筛选模型达到了高通量筛选的要求，实验结果稳定可靠，可以用于进行乙酰胆碱酯酶抑制剂的高通量筛选。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙酰胆碱酯酶抑制剂高通量筛选模型，其特征在于，包括步骤：(1)胆碱酯酶抑制剂筛选模型的建立与优化；(2)阳性药验证模型可靠性；(3)高通量筛选模型验证。

【技术特征摘要】
1.一种乙酰胆碱酯酶抑制剂高通量筛选模型，其特征在于，包括步骤：
(1)胆碱酯酶抑制剂筛选模型的建立与优化；
(2)阳性药验证模型可靠性；
(3)高通量筛选模型验证。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胆碱酯酶为乙酰胆碱酯酶。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中进行确定乙酰胆碱和乙酰胆碱酯
酶最适浓度的实验。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，配制不同浓度的乙酰胆碱，每
孔加入20μl，再每孔加入20μl1×反应buffer，配制给定浓度的Amplex Red reagent、辣根过
氧化酶、胆碱氧化酶、乙酰胆碱酯酶，等体积混合，每孔加入40μl，室温反应1h，检测荧光
强度，确定最适乙酰胆碱浓度为50μM；配制不同浓度的乙酰胆碱酯酶，每孔加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：严明，张陆勇，胡洁，高鹏，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32