一种表征聚电解质水凝胶平板膜厚度的改进方法技术

本发明专利技术涉及一种表征聚电解质水凝胶平板膜厚度的改进方法。将荧光标记的聚阳离子（或/和聚阴离子），通过静电作用形成聚电解质水凝胶平板膜，在确定激光共聚焦扫描显微镜gain值和offset值之后，借助激光共聚焦扫描显微镜，对平板水凝胶膜的Z轴进行层层扫描，可得到一系列的层扫照片，再对层扫照片进行荧光强度定量，会得到荧光强度与Z轴步进值的关系曲线，再对曲线进行分段拟合及分段求导，导数最大值和最小值所对应Z轴步进值的差即为凝胶膜的厚度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及材料领域，是一种表征聚电解质水凝胶平板膜厚度的方法。
技术介绍
膜厚是表征膜的一个重要参数。目前有关聚电解质水凝胶膜厚度测量方法主要有光学显微镜观察法，测微器测量法和荧光标记方法。光学显微镜观察法适用于比较厚的球形凝胶膜及平板凝胶膜，不适用于薄的平板凝胶膜。测微器测量法是将凝胶膜干燥后，测量凝胶膜厚度的方法；由于凝胶含水量很高，干燥后测得的凝胶膜厚度与真实凝胶膜厚度相差很大，因此这个方法使用受到限制。荧光标记方法是利用荧光探针标记的聚阳离子(或聚阴离子)，利用激光共聚焦扫描显微镜对Z轴进行层层扫描、三维重建，通过在三维重建形成的左视图或主视图划线，与标尺比对，确定凝胶膜厚度。由于激光共聚焦扫描显微镜的gain和offset值对凝胶膜厚度影响很大(见图1)，因此需要“参比”确定激光共聚焦扫描显微镜的gain和offset值。目前采用激光共聚焦测凝胶膜厚度方法存在以下问题:无法对激光共聚焦扫描显微镜gain和offset值进行确定且边界不易确定，人为因素影响大。 针对上述问题，本专利建立了激光共聚焦扫描显微镜gain和offset值确定方法及凝胶膜边界的确定方法，可对聚电解质水凝胶膜厚进行准确定量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可精确测量聚电解质络合水凝胶平板膜厚度的方法。 为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为: 一种表征聚电解质络合水凝胶平板膜厚度的改进方法，借助于激光共聚焦扫描显微镜进行操作，利用荧光标记的方法测平板凝胶膜的厚度。首先荧光探针标记聚阳离子，以荧光标记的聚阳离子与聚阴离子形成的凝胶微球膜为阳性对照，确定激光共聚焦扫描显微镜gain值和offset值； 采用荧光标记的聚阳离子聚合物溶液与聚阴离子聚合物形成的平板水凝胶反应，形成聚电解质络合水凝胶平板膜；采用已确定的激光共聚焦扫描显微镜gain值和offset值，利用激光共聚焦扫描显微镜对平板水凝胶膜的Z轴(Z轴方向:垂直于平板凝胶膜表面的方向)进行层层扫描，层扫厚度为0.5-10 μ m/层，可得到一系列层扫照片； 为表征水凝胶膜的厚度，需确定凝胶膜上层及下层边界:利用Image J软件确定层扫照片的荧光强度，会得到荧光强度与Z轴步进值(步进值:层扫厚度与每层层扫照片对应的层数之积)的关系曲线；再利用Origin软件对曲线进行分段(可分为3段:荧光强度增加阶段、荧光强度平衡阶段和荧光强度降低阶段)拟合及分段求导，导数最大值和最小值所对应Z轴步进值定义为凝胶膜上层及下层边界；导数最大值和最小值所对应Z轴步进值的差即为凝胶膜的厚度。 A、荧光探针标记聚阳离子聚合物，并配制标记的聚阳离子聚合物溶液。 B、将聚阴离子溶液置于载玻片上，通过化学或物理等交联剂形成聚阴离子水凝胶。 C、将粘附在载玻片上的聚阴离子水凝胶浸于荧光标记的聚阳离子聚合物溶液中，使其充分反应后，即形成聚电解质水凝胶平板膜，生理盐水清洗。 D、以步骤A获得的荧光标记阳离子聚合物制备的水凝胶微球膜为阳性对照，确定激光共聚焦扫描显微镜的gain值和offset值，采用激光共聚焦扫描显微镜对凝胶平板膜在Z轴上进行层层扫描。 E、对层扫照片进行荧光强度定量，得到荧光强度与Z轴步进值的关系曲线，再对曲线进行分段拟合及分段求导，导数最大值和最小值所对应Z轴步进值的差即为凝胶膜的厚度。 所述聚电解质水凝胶平板膜中的聚阳离子为壳聚糖及其衍生物，α或ε聚赖氨酸，聚鸟氨酸、聚精氨酸，聚胺及其衍生物、聚酰胺及其衍生物、聚酰亚胺及其衍生物，及上述聚阳离子的共聚物中的一种或二种以上，分子量在lkDa-500kDa。 所述聚电解质水凝胶平板膜中的聚阴离子为海藻酸盐、透明质酸盐及纤维素硫酸盐，及上述聚阴离子的共聚物中的一种或二种以上，分子量在lkDa-2000kDa。 所述荧光标记的聚阳离子为荧光标记反应后通过反复清洗抽滤、透析或者凝胶柱分离等方法纯化后的聚合物。 本专利技术具有以下优点: 1、对激光共聚焦测凝胶膜厚度条件进行了确定，为真实表征凝胶膜厚度提供了条件。 2、采用曲线拟合及边界求导方法，可准确确定凝胶膜厚度边界。 3、激光共聚焦扫描显微镜测凝胶厚度的分别率高，可检测凝胶膜厚度的下限为3 μ m。 【附图说明】 图1激光共聚焦扫描显微镜的gain和offset值对凝胶膜厚度的影响，光镜下观察微囊膜厚为?ο μ m，此数值为真实膜厚，绿色为微囊膜:(a)光镜下AC微囊；(b)Gain:335V，off set:-20%，激光共聚焦显微镜下绿色荧光对应膜厚为10 μ m，与真实值相同；(c)Gain: 430V，off set:-20%，激光共聚焦显微镜下绿色荧光对应的膜厚为48 μ m，远大于真实值；(d) Gain:480V，off set:-20%，激光共聚焦显微镜下绿色荧光对应膜厚为99 μ m，远远大于真实值，严重失真。 图2以FITC标记的壳聚糖溶液与海藻酸钙胶珠形成的AC微囊膜为参比，确定激光共聚焦扫描显微镜的gain值和offset值，绿色为AC微囊膜(放大倍数:1000倍)。 图3采用激光共聚焦扫描显微镜对AC平板膜的Z轴进行层层扫描，得到一系列图片。 图4对每层层扫照片进行荧光强度定量，会得到荧光强度与Z轴步进值的关系曲线。 图5对图4曲线进行拟合，并分别求导，导数最大值和最小值对应Z轴步进值(Zi和Z2)的差即为凝胶膜的厚度。 【具体实施方式】 比较实施例: 将lg壳聚糖溶于醋酸/醋酸钠缓冲体系，用4M NaOH溶液调壳聚糖溶液pH至中性。将lmg/ml FITC溶液(溶剂为甲醇)缓慢滴加到壳聚糖溶液中反应12h。采用4M NaOH溶液沉淀壳聚糖，50%乙醇洗至中性，100%乙醇洗至490nm处无吸收后，真空干燥过夜。配制0.5% (m/v, g/ml)FITC标记的壳聚糖溶液。采用微囊制备仪制备海藻酸钙微球。将海藻酸钠溶液置于载玻片上，浸于1.l%CaCl2溶液中，钙化30min形成海藻酸钙凝胶。将粘附在载玻片上的海藻酸钙凝胶及海藻酸钙微球浸于FITC标记的壳聚糖溶液中，使其充分反应，分别形成荧光标记的AC微囊膜和平板AC凝胶膜。 以FITC标记的壳聚糖溶液与海藻酸钙胶珠形成的AC微囊膜为参比，确定激光共聚焦扫描显微镜的gain值和offset值，见图1。(a)光镜下AC微囊；(b)Gain:335V，off set:-20%，激光共聚焦显微镜下绿色荧光对应膜厚为10 μ m，与真实值相同；(c)Gain: 430V，off set:-20%，激光共聚焦显微镜下绿色荧光对应的膜厚为48 μ m，远大于真实值；(d) Gain:480V，off set:-20%，激光共聚焦显微镜下绿色荧光对应膜厚为99 μ m，远远大于真实值，严重失真。由此可见，如果不通过AC微囊膜为参比，确定激光共聚焦扫描显微镜的gain值和offset值，直接对平板膜进行扫描会对实验结果带来很大的人为误差。 实施例:一种表征海藻酸钠-壳聚糖水凝胶平板膜厚度的方法 将lg壳聚糖溶于醋酸/醋酸钠缓冲体系，用4M NaOH溶液调壳聚糖溶液pH至中性。将lmg/ml FITC溶液(溶剂为甲醇)缓慢本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表征聚电解质络合水凝胶平板膜厚度的改进方法，其特征在于：借助于激光共聚焦扫描显微镜进行操作，利用荧光标记的方法测平板凝胶膜的厚度。首先荧光探针标记聚阳离子，以荧光标记的聚阳离子与聚阴离子形成的凝胶微球膜为阳性对照，确定激光共聚焦扫描显微镜gain值和offset值；采用荧光标记的聚阳离子聚合物溶液与聚阴离子聚合物形成的平板水凝胶反应，形成聚电解质络合水凝胶平板膜；采用已确定的激光共聚焦扫描显微镜gain值和offset值，利用激光共聚焦扫描显微镜对平板水凝胶膜的Z轴（Z轴方向：垂直于平板凝胶膜表面的方向）进行层层扫描，层扫厚度为0.5‑10μm/层，可得到一系列层扫照片；为表征水凝胶膜的厚度，需确定凝胶膜上层及下层边界：利用Image J软件确定层扫照片的荧光强度，会得到荧光强度与Z轴步进值（步进值：层扫厚度与每层层扫照片对应的层数之积）的关系曲线；再利用Origin软件对曲线进行分段（可分为3段：荧光强度增加阶段、荧光强度平衡阶段和荧光强度降低阶段）拟合及分段求导，导数最大值和最小值所对应Z轴步进值定义为凝胶膜上层及下层边界；导数最大值和最小值所对应Z轴步进值的差即为凝胶膜的厚度。...

【技术特征摘要】
1.一种表征聚电解质络合水凝胶平板膜厚度的改进方法，其特征在于: 借助于激光共聚焦扫描显微镜进行操作，利用荧光标记的方法测平板凝胶膜的厚度。首先荧光探针标记聚阳离子，以荧光标记的聚阳离子与聚阴离子形成的凝胶微球膜为阳性对照，确定激光共聚焦扫描显微镜gain值和offset值； 采用荧光标记的聚阳离子聚合物溶液与聚阴离子聚合物形成的平板水凝胶反应，形成聚电解质络合水凝胶平板膜；采用已确定的激光共聚焦扫描显微镜gain值和offset值，利用激光共聚焦扫描显微镜对平板水凝胶膜的Z轴(Z轴方向:垂直于平板凝胶膜表面的方向)进行层层扫描，层扫厚度为0.5-10 μ m/层，可得到一系列层扫照片； 为表征水凝胶膜的厚度，需确定凝胶膜上层及下层边界:利用Image J软件确定层扫照片的荧光强度，会得到荧光强度与Z轴步进值(步进值:层扫厚度与每层层扫照片对应的层数之积)的关系曲线；再利用Origin软件对曲线进行分段(可分为3段:荧光强度增加阶段、荧光强度平衡阶段和荧光强度降低阶段)拟合及分段求导，导数最大值和最小值所对应Z轴步进值定义为凝胶膜上层及下层边界；导数最大值和最小值所对应Z轴步进值的差即为凝胶膜的厚度。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述表征膜厚的具体步骤如下: A、荧光探针标记聚阳离子聚合物，并配制标记的聚阳离子聚合物溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：马小军，宋益哲，于炜婷，王秀丽，徐小溪，郑国爽，李楠，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21