用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物及其应用制造技术

本发明专利技术提供用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物及其应用，属于生物技术领域。用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，活性成分为甲基-β-环糊精和吐温-80。本发明专利技术还提供制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，宿主细胞在接种猪圆环病毒2型之前，采用所述组合物处理1-6h。本发明专利技术用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，能够显著提高猪圆环病毒2型对PK-15细胞的感染效率。本发明专利技术制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，仅仅经过5代培养，每毫升病毒液的滴度就达到了107.5TCID50。

【技术实现步骤摘要】
用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物及其应用。
技术介绍
猪圆环病毒(porcinecircovirus，PCV)是迄今发现的最小的病毒，无囊膜、基因组为单股环状DNA。猪圆环病毒分PCV1和PCV2(猪圆环病毒2型)两个血清型，其中，PCV1对猪没有致病性。上世纪90年代初，从断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)中分离PCV2，PCV2自出现起即被认为是危害世界养猪业重要的病原。现已证明PCV2还可以造成育肥猪皮炎肾病综合征(porcinedermatitisandnephropathysdrome,PDNS)、PCV2相关性繁殖障碍、猪呼吸道疾病综合征(porcinerespiratorydiseasecomplex，PRDC)和先天性震颤(congenitaltremors,CT)等疾病。现将PCV2所引起的各种疾病统称为猪圆环相关性疾病(PCVAD)。随着商品化PCV2疫苗的成功使用，PCVAD得到有效控制。无论在商业化的养殖场，还是在实验条件下，商品化的PCV2疫苗均能有效保护PCV2的感染。由于PCV2在PK-15细胞系复制效率较低，因此市售疫苗抗原采用在PK-15细胞接毒后多次传代的方法不断提高病毒滴度，并伴随使用刺激剂。即便如此，大部分PCV2疫苗灭活前疫苗抗原含量也仅仅能达到106.0TCID50/mL左右。这严重制约了疫苗的产量，并使疫苗的价格显著上升，为研制高效、经济的PCV2疫苗带来了障碍。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，能够显著提高猪圆环病毒2型对PK-15细胞的感染效率。本专利技术的另一目的是提供制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，仅仅经过5代培养，每毫升病毒液的滴度就达到了107.5TCID50。本专利技术的目的采用如下技术方案实现。用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，活性成分为甲基-β-环糊精和吐温-80。优选的技术方案中，所述组合物中甲基-β-环糊精的浓度为1.0-4g/L，吐温-80的体积浓度为0.5-5ml/L。优选的技术方案中，所述组合物还含有MEM培养基。一种制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，宿主细胞在接种猪圆环病毒2型之前，采用权利要求1-3之一所述组合物处理1-6h。优选的技术方案中，所述宿主细胞为PK-15细胞。优选的技术方案中，所述宿主细胞采用所述组合物处理后，弃去所述组合物，接种猪圆环病毒2型，进行病毒的细胞培养。优选的技术方案中，所述猪圆环病毒2型的传代次数为4-6次，每代培养时间为40-80小时。优选的技术方案中，所述传代比例为1:2-4。本专利技术用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，能够显著提高猪圆环病毒2型对PK-15细胞的感染效率，价格低廉。本专利技术制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，仅仅经过5代培养，每毫升病毒液的滴度就达到了107.5TCID50。该方法显著降低了人力和疫苗成本。附图说明图1.不同刺激物刺激PK-15细胞后PCV2DBN-SX07株感染效率间接免疫荧光图片.其中A：阴性对照孔的间接免疫荧光图片；B：阳性对照孔的间接免疫荧光图片；C：刺激物B1处理孔的间接免疫荧光图片；D：刺激物B2处理孔的间接免疫荧光图片；E：刺激物B3处理孔的间接免疫荧光图片；F：刺激物A1处理孔的间接免疫荧光图片；G：刺激物A2处理孔的间接免疫荧光图片；H：刺激物A3处理孔的间接免疫荧光图片；I：刺激物C1处理孔的间接免疫荧光图片；J：刺激物C2处理孔的间接免疫荧光图片；K：刺激物C3处理孔的间接免疫荧光图片。图2.实施例3中各方法获得的第3代和第5代细胞培养物中阳性细胞间接免疫荧光图片。Control为未刺激PK-15细胞后接毒第3代和第5代细胞培养物中阳性细胞间接免疫荧光图片；A1、A2或A3分别为刺激物A1、A2或A3刺激PK-15细胞后制备的第3代和第5代细胞培养物中阳性细胞间接免疫荧光图片；B1、B2或B3分别为刺激物B1、B2或B3刺激PK-15细胞后制备的第3代和第5代细胞培养物中阳性细胞间接免疫荧光图片；C1、C2和C3分别为刺激物C1、C2、C3刺激PK-15细胞后制备的第3代和第5代细胞培养物中阳性细胞间接免疫荧光图片。具体实施方式：本专利技术组合物能够提高PCV2感染效率，本专利技术中以PCV2DBN-SX07株为例。PCV2DBN-SX07株(GenbankNO.：FJ660968)公开于猪圆环病毒2型毒株分离鉴定和体外增殖特性研究[J]，王贵华等，中国畜牧兽医2012年第39卷第一期，17～22。D-氨基葡萄糖、吐温-80(Tween-80)和甲基-β-环糊精(Methyl-beta-cyclodextrin，缩写MβCD)购自CRODA和Sigma。MEM培养基购自Gibco。PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)：是含有137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、10mM磷酸二氢钠和2mM磷酸二氢钾的水溶液。PBST缓冲液：含0.5‰(体积浓度)Tween-20的PBS缓冲液。PK-15细胞系(ATCC,AmericanTypeCultureCollection)，接毒前在含血清MEM培养基中逐步传代克隆以去除PCV1污染。MOI(multiplicityofinfection):感染复数。实施例1本专利技术组合物提高PCV2对PK-15细胞的感染效率1.刺激物的筛选在MEM培养基中添加不同浓度Tween-80、MβCD配制刺激物，考察这两种物质单独或者共同刺激PK-15细胞，对PCV2病毒感染效率的影响，刺激物中Tween-80、MβCD的含量如表1所示。表1刺激物中Tween-80、MβCD的含量在96孔板的每孔中平铺1×104PK-15细胞，铺板24h后采用表1中各刺激物分别进行刺激作用。每种刺激物作三个重复孔，每孔中加入刺激物100μL。各刺激物作用6h后，弃去刺激物，并用MEM培养基清洗各孔。按照感染复数MOI＝0.05，在各孔中接种PCV2DBN-SX07株，然后加入维持培养基，培养48h。维持培养基：在MEM培养基中添加终浓度为3mmol/LD-氨基葡萄糖和2％(体积百份浓度)血清。阳性对照孔中不加入任何刺激物，其他步骤同加入刺激物的孔。阴性对照孔中不加入刺激物、不接种病毒，其他步骤同加入刺激物的孔。病毒培养结束后，采用间接免疫荧光(IFA)方法检测PCV2DBN-SX07株的感染效率。IFA方法具体如下：在4℃条件下，用冰预冷的无水乙醇固定96孔板中的细胞1h，用PBST缓冲液洗涤，加入按1∶200倍稀释的PCV2阳性猪血清(购于VMRD公司),37℃孵育1h，PBST缓冲液洗涤5次，每次5min。然后，加入FITC-SPA荧光二抗(荧光标记葡萄球菌A蛋白，武汉博士德)，37℃孵育lh，PBST缓冲液洗涤5次，每次5min，于荧光显微镜下观察(Zeiss)。计算刺激物作用孔与阳性对照孔中阳性细胞数量，计算感染效率。结果如图1，与阳性对照孔相比，刺激物B1、B2和B3分别刺激PK-15细胞后，PCV2DBN-SX07株的感染效率提高了400％；刺激物A1、A2和A3分别刺激PK-15细胞后，PCV2DBN-SX07株的感本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，活性成分为甲基‑β‑环糊精和吐温‑80。

【技术特征摘要】
1.用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，活性成分为甲基-β-环糊精和吐温-80；所述组合物中甲基-β-环糊精的浓度为1.0-4g/L，吐温-80的体积浓度为0.5-5ml/L。2.根据权利要求1所述用于提高猪圆环病毒2型感染效率的组合物，其特征在于所述组合物还含有MEM培养基。3.一种制备猪圆环病毒2型病毒液的方法，其特征在于宿主细胞在接种猪圆环病毒2型之前，采用权利要求1-2之一所述组合物处理1-6h。4.根据权利要求3所述制备猪圆环病毒2...

【专利技术属性】
技术研发人员：华涛，侯继波，张雪花，冯磊，陈丽，吴培培，张道华，唐波，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32