本发明专利技术涉及一种神经氨酸酶抑制剂的筛选方法和应用，该方法系电泳介导的微分析技术，在毛细管中用酶催化水解底物的一步反应，然后在紫外214nm处直接测定产物峰面积实现酶活的测定和酶抑制剂的筛选方法；该方法不仅具有快速简便、试剂消耗少、易于自动化、准确性高的优点，而且适用于神经氨酸酶抑制剂的筛选和分析，尤其适用于如中药粗提液等混合化合物样品中神经氨酸酶抑制剂的筛选且为快速筛选发现抗流感病毒药物奠定理论基础。
【技术实现步骤摘要】
神经氨酸酶抑制剂筛选方法和应用
本专利技术属于酶抑制剂筛选方法，特别涉及的是神经氨酸酶抑制剂的筛选方法和应 用，可以用于中药粗提物、海洋药物标准组分和小分子化合物的高通量筛选等方面。
技术介绍
威胁人类健康的疾病大都被发现与相关酶的失调密切联系，因此酶是目前新药研 制的重要靶标。据统计，酶抑制剂类药物约占目前整个药物市场份额的47%。对于酶抑制 剂类药物的开发来讲，发现新的对靶标酶有抑制活性的酶抑制剂化合物是药物开发初期的 主要任务。现在，虽然可以通过组合化学合成和天然产物提取的方式得到成千上万的化合 物，但如何快速地从这数量巨大的化合物库中筛选出有活性的药物先导化合物仍然是新药 开发的瓶颈。作为一种急性呼吸道传染疾病，流行性感冒（流感）一直以来都严重影响着人 类的生命健康。据世界卫生组织的统计，季节性流感的流行每年都会造成300-500万例严 重病例，并导致25-50万人死亡。流感世界范围的大流行更是会带来灾难性的后果。神经 氨酸酶（neuraminidase，NA)是存在于病毒、菌及哺乳动物细胞中有唾液酸酶活性的糖蛋 白，具有唾液酸酶活性，在甲、乙型流感病毒的复制、感染和致病过程中起重要作用；抑制流 感病毒的神经氨酸酶活性，可有效地控制甲、乙型流感病毒感染引起的流感症状和疾病的 传播。因此，以神经氨酸酶为靶点，筛选神经氨酸酶抑制剂，是研究和开发抗甲、乙型流感病 毒药物的一个重要途径。 酶筛选模型是分子水平筛选模型中的一种，因其具有耗材量少、药物作用机制明 确、筛选规模大等优点，在药物筛选领域引起人们极大的关注。在传统的以酶为靶点的抗 流感病毒活性筛选方法中，大都采用在一定条件下令酶和底物反应，待反应终止后利用紫 外-可见分光光度法或荧光法来检测产物，通过计算待筛样品加入前后吸收度的变化得到 抑制剂的抑制率。该方法突出的优点是设备简单易于推广，但缺点是人工操作、费时不易实 现高通量筛选，同时反应受外界条件变化影响大、需要酶的量较大、对复杂样品进行筛选时 基体干扰最终的观测。 毛细管电泳（CE)作为继HPLC之后又一强有力的分离分析方法，具有高的分离效 能和灵活多样的分离方式，有望成为药物筛选多样化的新平台。电泳中介微分析（EMMA)是 在流动注射分析（FIA)和毛细管电泳（CE)基础上诞生的一项新的分析技术。该技术是将 试样和试剂作为两个独立的区带先后注入毛细管内，淌度大者在后，经过一定时间的运行 两者完全混合并反应，所得产物与试剂经电泳分离并流向检测器检测。因 EMM具有反应和 检测的一体化、试剂消耗量为纳升级、反应分离速度快、可实现高通量、不受复杂样品基质 的干扰等优点，被广泛应用于天然产物中酶激动剂、抑制剂的研究及抑制剂对酶抑制作用 机理研究等诸多领域。Hamdan等建立的天然植物提取物中a-淀粉酶抑制剂的EMMA筛选 方法，（I. I. Hamdan, F. U. Afifi. Saudi Pharmaceutical Journal, 2010，18: 91-95.) 首次从 roAer i和 Je1ScWw1S 中发现了 a_ 淀粉酶抑制剂。 Nehm6 课题组以激酶 CDK5 为革巴点，（R. Nehm6, H. Nehm6, G. Roux, et al. Journal of Chromatography A, 2013，1318: 257-264.)建立天然产物黄酮及其衍生产物的CE抗肿 瘤活性筛选方法。赵书林课题组先后建立了天然产物中a-葡萄糖苷酶（A. Z. Zhang，F. G. Ye, J. Υ· Lu, S. L. Zhao. FoodChemistry, 2013，141: 1854-1859·)、腺苷脱氨酶 (X. ff. Ji, F. G. Ye, P. T. Lin, S. L Zhao. Talanta, 2010, 82: 1170-1174.)、单 胺氧化酶（K. Hu, L. C. Zhang, X. T. Li, S. L. Zhao. Journal of Chromatography B，2010，878: 3156-3160.)抑制剂的CE筛选方法，利用CE超强的的分离能力，对天然产 物的粗提物进行筛选。最近，康经武课题组报道了天然产物中蛋白激酶抑制剂的CE筛选方 法。（T. D. Wang, Q. Q. Zhang, Y. M. Zhang, J. ff. Kang. Journal of Chromatography A，2014，1337: 188-193.)在以前的研究中，我们课题组建立了中草药粗提物中a-葡 萄糖苷酶和酪氨酸酶抑制剂的CE筛选方法，（T.-F. Jiang，T.-T. Liang，Y.-H. Wang， Z. -H. Lv. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2013, 84: 36-40. L. -P. Guo, T. -F. Jiang, Z. -H. Lv, Y. -H. Wang. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2010，53: 1250-1253.)并利用所建立的方法研究了酶抑制剂动 力学和抑制机理。从文献报道来看，目前，尚无采用EMMA技术进行神经氨酸酶活性测定和 抑制剂筛选的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种神经氨酸酶抑制剂的快速筛选方法。即利用该酶催化水 解底物的一步反应，运用电泳介导的微分析技术在紫外214nm处直接测定产物峰面积实现 酶活的测定和酶抑制剂的筛选。 本专利技术的又一目的是应用上述方法，快速、准确地确定抑制剂化合物的半数抑制 浓度即IC 5tl值及抑制常数Ki值，为快速筛选具有神经氨酸酶抑制作用的先导化合物奠定坚 实的理论基础，为开发抗流感病毒新药提供可能。 本专利技术中所述的电泳介导的微分析技术属于毛细管电泳技术的一种模式，所用的 仪器设备为毛细管电泳仪，推荐采用安捷伦毛细管电泳仪。 所述的毛细管柱总长是20-100cm，柱内径为25-100Mm，优选长度30-80cm，内径 25_75Mm。 本专利技术的酶活测定和抑制剂筛选通过如下步骤来实现，其示意图如图1所示：1) 将反应缓冲液、酶溶液和底物溶液分别以1 - 100纳升体积依次导入毛细管一端，所述的底 物溶液可以含或不含待筛选化合物，可测的酶的浓度范围为Ο-lmg/mL，推荐酶的浓度范围 为0. 1-lmg/mL，底物的浓度范围为0-200mM;2)使酶和底物反应一段时间，一般为0-20分 钟；3)加上一定电压，使酶、未反应底物及产物根据其电泳淌度的不同来实现分离，通常电 压为1千伏至30千伏。酶活用214nm处产物峰面积表示。待筛选化合物可根据产物峰面 积的变化来判定其是否具有抑制酶的活性。通常电泳分离采用PH为2-12的缓冲液，最好 采用PH为6-10缓冲液，其浓度为10-300mmol/L。酶与底物反应采用pH为2-12的缓冲液， 最好采用pH为2-6缓冲液，其浓度为10-300mmol/L。所用的缓冲液可以为硼酸盐、磷本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种神经氨酸酶抑制剂的筛选方法，其特征是采用电泳介导的微分析技术，在毛细管中用酶催化水解底物的一步反应，然后在紫外214 nm处直接测定产物峰面积实现酶活的测定和酶抑制剂的筛选方法；所述的酶为神经氨酸酶；所述的底物为2‑(4‑甲基伞形酮‑a‑N‑乙酰神经氨酸)。
【技术特征摘要】
1. 一种神经氨酸酶抑制剂的筛选方法，其特征是采用电泳介导的微分析技术，在毛细 管中用酶催化水解底物的一步反应，然后在紫外214 nm处直接测定产物峰面积实现酶活的 测定和酶抑制剂的筛选方法； 所述的酶为神经氨酸酶； 所述的底物为2-(4-甲基伞形酮-a-N-乙酰神经氨酸）。2. 根据权利要求1所述的一种神经氨酸酶抑制剂的筛选方法，其特征在于： 1) 将反应缓冲液、酶溶液和底物溶液分别以1-100纳升体积依次导入经过分离缓冲液 处理过的毛细管，所述的酶的浓度范围为0-1 mg/mL，底物的浓度范围为0-200 mM，所述的 底物溶液含或不含待筛选化合物； 2) 使酶和底物反应0-20分钟； 3) 加上1千伏至30千伏电压进行电泳分离；酶活用214nm处产物峰面积表示； 所述的缓冲液是pH为2_12缓冲液。3. 根据权利...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜廷福，种蕾，吕志华，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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