本发明专利技术提供猪流行性腹泻灭活疫苗及其制备方法，涉及生物制药领域。猪流行性腹泻灭活疫苗，含有灭活的猪流行性腹泻病毒，其特征在于所述猪流行性腹泻灭活疫苗中含有0.05-10mg/mL的β-葡萄糖神经酰胺、0.1-21mg/mL的单磷酰脂质A、1.5-125mg/mL的胞壁酰二肽和0.7-4.5mg/mL的β-葡聚糖。本发明专利技术猪流行性腹泻灭活疫苗，其成分中的β-葡萄糖神经酰胺与单磷酰脂质A、胞壁酰二肽和β-葡聚糖具有协同增效作用，显著提高动物对疫苗中抗原的免疫应答，缩短免疫窗口期，显著延长动物机体抗体产生持续期、提高血清抗体水平和肠道黏膜总分泌型抗体（总SIgA）水平。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物制药领域，具体涉及猪流行性腹泻灭活疫苗及其制备方法。
技术介绍
猪流行性腹泻（Porcine Epedemic Diarrhea ，PED）是一种急性、经粪-口途径传播的传染病，临床上以黄绿色水样腹泻、呕吐、脱水和新生仔猪的高死亡率为特征。 本病70年代初首次发现于英国和比利时，1978年先后在我国上海、辽宁、吉林、黑龙江等地分离到病毒抗原。流行性腹泻病毒（PEDV）和传染性胃肠炎病毒抗原形态，临床症状，流行病学及其相似，但免疫学和血清学相互没有交叉反应，当前我国发病猪病毒性腹泻主要为PED。 PED流行主要发生在冬季，但有的地区猪场一年四季均发病。病猪是主要的传染源，病毒随粪便排出污染周围环境、衣服、车辆等散播传染，健康猪经粪-口途径自然感染。PED对哺乳仔猪、架子猪和育肥猪发病率可达100％，其中以哺乳仔猪受害最为严重，特别是10日龄以内仔猪，发病死亡率100％，其他猪呈隐性感染，并持续排毒。 健康猪感染PED后迅速腹泻，排水样黄绿色粪便，呕吐多发生于吃奶之后，发病猪体温正常，濒死时体温降低。病变主要部位是小肠，临床表现为肠壁变薄、肠道鼓气，肠内有大量黄色液体，严重时肠道、肠系膜充血，肠系膜淋巴结充血、肿大。 当前防治PED的有效手段是免疫接种，但在防治的过程中出现的问题有：传统PED疫苗免疫后抗体产生窗口期长，给易感猪带来极大的感染风险；传统PED疫苗免疫后易感动物肠道黏膜总分泌型抗体（肠道黏膜总SIgA）不足，不能有效中和肠道内病毒。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供猪流行性腹泻灭活疫苗，其成分中的β-葡萄糖神经酰胺与单磷酰脂质A、胞壁酰二肽和β-葡聚糖具有协同增效作用，显著提高动物对疫苗中抗原的免疫应答，缩短免疫窗口期，显著延长动物机体抗体产生持续期、提高血清抗体水平和肠道黏膜总分泌型抗体（总SIgA）水平。 本专利技术的另一目的是提供猪流行性腹泻灭活疫苗的制备方法，该方法操作简单，方便。 本专利技术的目的采用如下技术方案实现。 猪流行性腹泻灭活疫苗，含有灭活的猪流行性腹泻病毒，含有0.05-10mg/mL的β-葡萄糖神经酰胺、0.1-21mg/mL的单磷酰脂质A、1.5-125mg /mL的胞壁酰二肽和0.7-4.5mg /mL的β-葡聚糖。 优选的技术方案中，所述灭活疫苗为油乳剂。 本专利技术还提供所述猪流行性腹泻灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤： （1）配制水相溶液：将单膦酰脂质A、胞壁酰二肽、β-葡聚糖与灭活的猪流行性腹泻病毒液混合均匀，得到病毒液1；将病毒液1与吐温-80混合均匀，得到水相溶液；（2）配制油相溶液：将β-葡萄糖神经酰胺溶于白油和司盘-80的混合物中，得到油相溶液；（3）将所述水相溶液与油相溶液混合，乳化，得灭活疫苗。在本专利技术中，所述病毒液1与吐温-80的体积比为90-100:4。 在本专利技术中，所述白油与司盘-80的体积比为90-100:4。 在本专利技术中，所述水相溶液与油相溶液的体积比为1:1-3。 本专利技术灭活疫苗的最终使用对象为猪，疫苗中病毒含量至少为107TCID50/mL，免疫程序可以为1次或两次：免疫1次，产前1个月免疫，2ml/次；免疫2次，产前1个月免疫1次，产前半个月免疫1次，免疫剂量1ml/次。 本专利技术的目的是提供猪流行性腹泻灭活疫苗，其成分中的β-葡萄糖神经酰胺与单磷酰脂质A、胞壁酰二肽和β-葡聚糖具有协同增效作用，显著提高动物对疫苗中抗原的免疫应答，缩短免疫窗口期，显著延长动物机体抗体产生持续期、提高血清抗体水平和肠道黏膜总分泌型抗体（总SIgA）水平。本专利技术猪流行性腹泻灭活疫苗的制备方法，该方法操作简单，方便。 附图说明图1表示小鼠免疫不同组灭活疫苗后血清中流行性腹泻平均抗体水平随时间的变化。 图2：表示小鼠免疫不同组灭活疫苗后28天肠道SIgA抗体检测水平。 下面的实施例是对本专利技术的进一步说明，但不意味着对本专利技术的任何限制。本实施例中试验动物是SRC小鼠，是本专利技术实验室前期阶段动物模型，不对本专利技术最终应用有任何限制。具体实施方式实施例11. 实验材料单膦酰脂质A、胞壁酰二肽、β-葡聚糖均购自InvivoGen公司。β-葡萄糖神经酰胺购自美国Avanti Polar Lipids公司。6周龄健康SRC小鼠，购自南京医科大实验动物中心。流行性腹泻抗体检测试剂盒，购自哈尔滨科华生物公司。小鼠肠道总SIgA ELISA检测试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。PEDV CV777株：公开于猪流行性腹泻灭活疫苗的研究 王明，马思奇等 中国畜禽传染病 1993 [J]。2. 疫苗制备 灭活疫苗A配制方法如下：（1）制备水相溶液：将灭活的猪流行性腹泻病毒液（毒株为PEDV CV777株,灭活前毒价5×107.5TCID/mL）与吐温-80按体积比96:4混合，制成水相溶液。（2）制备油相溶液：将白油和司盘-80按体积比96:4 混合，无菌处理，制成油相溶液。 （3）将水相溶液与油相溶液按体积比1:2混合，乳化，得油乳剂型灭活疫苗A。 灭活疫苗B中含有5mg/mL单磷酰脂质A、20mg/mL胞壁酰二肽、2mg/mLβ-葡聚糖，配制方法如下： （1）制备水相溶液：将单磷酰脂质A、胞壁酰二肽、β-葡聚糖溶解于灭活的猪流行性腹泻病毒液（毒株：PEDV CV777,灭活前毒价5×107.5TCID/mL）中，得到病毒液1。将病毒液1与吐温-80按体积比96:4混合均匀，制成水相溶液。（2）制备油相溶液：将白油和司盘-80按体积比96:4 混合均匀，无菌处理，制成油相溶液。 （3）将水相溶液与油相溶液按体积比1:2混合，乳化，得油乳剂型灭活疫苗B。 灭活疫苗C中含有5mg/mLβ-葡萄糖神经酰胺，配制方法如下： （1）制备水相溶液：将灭活的猪流行性腹泻病毒液（毒株：PEDV CV777,灭活前毒价5×107.5TCID/mL）与吐温-80按体积比96:4混合，制成水相溶液。（2）制备油相溶液：将白油和司盘-80按体积比96:4 混合均匀，无菌处理，将β-葡萄糖神经酰胺溶解到白油和司盘-80的混合物中，制成油相溶液。 （3）将水相溶液与油相溶液按体积比1:2混合，乳化，得油乳剂型灭活疫苗C。 灭活疫苗D中含有5mg/mL单磷酰脂质A、20mg/mL胞壁酰二肽、2mg/mLβ-葡聚糖和5mg/mLβ-葡萄糖神经酰胺，配制方法如下： （1）制备水相溶液：将单磷酰脂质A、胞壁酰二肽、β-葡聚糖溶解于灭活的猪流行性腹泻病毒液（毒株：PEDV CV777,灭活前毒价5×107.5TCID/mL）中，得到病毒液1。将病毒液1与吐温-80按体积比96:4混合，制成水相溶液。（2）制备油相溶液：将白油和司盘-80按本文档来自技高网...
【技术保护点】
猪流行性腹泻灭活疫苗，含有灭活的猪流行性腹泻病毒，其特征在于所述猪流行性腹泻灭活疫苗中含有0.05‑10mg/mL的β‑葡萄糖神经酰胺、0.1‑21mg/mL的单磷酰脂质A、1.5‑125mg /mL的胞壁酰二肽和0.7‑4.5mg /mL的β‑葡聚糖。
【技术特征摘要】
1.猪流行性腹泻灭活疫苗，含有灭活的猪流行性腹泻病毒，其特征在于所述猪流行性腹泻灭活疫苗中含有0.05-10mg/mL的β-葡萄糖神经酰胺、0.1-21mg/mL的单磷酰脂质A、1.5-125mg /mL的胞壁酰二肽和0.7-4.5mg /mL的β-葡聚糖。
2.根据权利要求1所述猪流行性腹泻灭活疫苗，其特征在于所述灭活疫苗为油乳剂。
3.权利要求1或2所述猪流行性腹泻灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：
（1）配制水相溶液：将单膦酰脂质A、胞壁酰二肽、β-葡聚糖与灭活的猪流行性腹泻病毒液混合均匀，得到病毒液1；将病毒液1与吐...
【专利技术属性】
技术研发人员：于晓明，陈瑾，侯立婷，李鹏成，乔绪稳，吴楠，郑其升，侯继波，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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