来源于瓜类炭疽病菌的漆酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种优化后适用于毕赤酵母表达的漆酶ClLACI序列及其表达应用。所述漆酶ClLACI的核苷酸序列如SEQIDNo1，全长1716bp，其编码的蛋白质序列如SEQIDNo2，共567个氨基酸。通过将该序列构建到毕赤酵母表达载体并转化入毕赤酵母中表达，可用于漆酶的生产。

【技术实现步骤摘要】
来源于瓜类炭疸病菌的漆酶基因及其应用
本专利技术属微生物
，具体涉及一种优化后适用于毕赤酵母表达的漆酶ClLACI序列及其应用。
技术介绍
近年来，随着基因测序技术的飞速发展，大量的基因信息被公布。在NCBI数据库中，许多编码蛋白的序列通过生物信息学分析，都已被分类注释。但大多数蛋白的生理生化功能都是未知的。因此，研究这些蛋白的功能，开发期应用潜力，具有重要意义。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，属于多铜氧化酶家族。它能催化多种底物，包括:酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、羧酸及其衍生物、生物色素与留体激素、金属有机化合物等。在介体存在的条件下，漆酶的底物范围还能进一步扩大。可应用于造纸、纺织、生物合成、废水处理等诸多领域。瓜类炭疽菌--)是一种能够引起瓜类产生炭疽病的致病菌。本专利技术所述的漆酶基因既是来源于这种微生物，直接从其中分离并纯化目的漆酶，难度大、耗时长、成本高。而毕赤酵母表达系统可以分泌表达外源蛋白，易于纯化，且发酵方法成熟、操作简单，是生产漆酶的理想方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种优化后适用于毕赤酵母表达的漆酶ClLACI序列及其应用。基于野生型基因序列，删除组成N端信号肽的23个氨基酸的基因序列。按毕赤酵母偏爱密码子，避免基因中出现ATTTA等PolyA加尾信号，避免6个或更多的连续的Α+Τ序列，避免5个或更多的G+C序列，G+C的比例40-60%，防止内含子切割序列，减少基因内部的两级结构hairpins等原则优化基因，并消除内部酶切位点。 所述优化的漆酶ClLACI的核苷酸序列如SEQ ID NO I所示。 所述优化的漆酶ClLACI的核苷酸序列编码的蛋白质序列如SEQ ID NO 2所示。 本专利技术按照毕赤酵母偏爱密码子对原始的LlLAC进行改造，改造后的基因序列与原序列(GenBank: AB055709.1)同源性为76.3% (参见图1)，其编码的蛋白质共567个氨基酸。 将基因片段与T/A克隆载体相连(Takara)，4°C连接过夜，高效转化DH5a感受态中，获得阳性克隆。抽取该阳性克隆质粒，经汉挪份和5^ 2双酶切后，通过T4 DNA连接酶与毕赤酵母表达载体pPIC9K (invitrogen)连接,酶切鉴定和序列测定获得了含有目的基因的重组质粒PPIC9K-C1LACI (参见图2)。 利用电击法将上述PPIC9K-C1LACI质粒转入毕赤酵母GS115菌中，筛选到的阳性菌株经lwt%甲醇摇瓶诱导48 h后，上清中表达量达到0.017 mg/mL。最适pH为3.6?4.0，在pH 3.6?7.0范围内比较稳定。最适反应温度为401:。在介体(48了5: 2，2’-联氨-双-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二胺盐)存在的条件下，能有效脱色染料孔雀绿与结晶紫。 有益效果:本专利技术按合成的ClLACI基因可以在毕赤酵母中表达出漆酶，在造纸、纺织、生物合成、废水处理等诸多领域有广泛的应用潜力。 【附图说明】 图1为ClLACI和原始ClLAC基因序列比对:wt为原始基因；y为优化的ClLAC基因。 图2为用于毕赤酵母表达的PPIC9K-C1LACI载体。 图3为该酶的最适温度。 图4为该酶的温度稳定性。 图5为该酶的最适pH。 图6为该酶的pH稳定性。 图7为漆酶对染料孔雀绿与结晶紫的脱色效果。 【具体实施方式】 下面结合【具体实施方式】来进一步阐述本专利技术。实施例仅用以说明本专利技术的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施对本专利技术进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对专利技术的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术的技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本专利技术的权利要求范围中。 本专利技术实施中未注明的实验方法，如连接、转化、相关培养基的配制等参照分子克隆实验指南第三版(黄培堂等译，中国，科学出版社，2002)和毕赤酵母表达手册(invitrogen)中方法进行。未注明的化学药品为分析纯级，购自上海国药集团有限公司。 实施例1ClLACI基因在毕赤酵母中的分泌表达一、毕赤酵母表达载体的构建基于野生型基因序列，删除组成N端信号肽的23个氨基酸的基因序列。按毕赤酵母偏爱密码子，避免基因中出现ATTTA等PolyA加尾信号，避免6个或更多的连续的A+T序列，避免5个或更多的G+C序列，G+C的比例40-60%，防止内含子切割序列，减少基因内部的两级结构hairpins等原则优化基因，并消除内部酶切位点。序列如SEQ ID NO I所示,全基因由南京金斯瑞公司合成。 将基因片段与T/A克隆载体相连(Takara)，高效转入DH5a感受态中，获得阳性克隆。抽取阳性克隆质粒，经汉挪份和5^ 2双酶切后，以正确的阅读框插入到毕赤酵母表达载体PPIC9K中，测序验证，得到重组质粒PPIC9K-C1LACI (参见图2)。相关的DNA回收试剂盒、载体、连接酶、核酸内切酶均购自Takara公司，DH5 a感受态由本实验室保存。 二、毕赤酵母的转化 挑取划线培养的 GS115 (mut+his、invitrogen)单克隆接种到 10 mL YPD, 30°C, 225rpm培养过夜，取I mL转接到100 mL新鲜YPD中继续培养，继续培养3_5h至0D_=0.5，5000 rpm离心收集菌体。用等体积重蒸水洗涤两次后，加入I mL预冷的山梨醇悬浮菌体，即可作为毕赤酵母感受态。 大量抽取PPIC9K-C1LACI质粒DNA，经bgl II线性化后，用电击法转入感受态细胞。用B1-Red GenePulser电击仪电击，参数2.5 kV，25 PF。电击结束后，立即加入0.8mL预冷的1.0 mo I/L山梨醇，取200 PL涂布于SD_his培养基平板，30°C培养3_4天至转化子出现。由于受体酵母为His缺陷型(His_)，在不加His的基本培养基上不生长，只有整合得到的重组酵母才能正常生长。通过这一标记，筛选得到大量的His+转化子。 三、毕赤酵母的筛选与诱导表达采用小规模发酵筛选活性高的转化子，具体操作方法为:接种单个转化子到含有50μ L BMMY (10 g/L 酵母提取物、20 g/L 蛋白胨、13.4 g/L YNB,0.4 mg/L 生物素、1被％甲醇)的96孔板中，28°C，225 rpm振荡培养24h，加入10 μ L反应底物1%愈创木酚、20 μ L40mM硫酸铜及120 μ L缓冲液(pH 4.0 ,0.2M柠檬酸-磷酸氢二钠)。37°C反应2 h，变为棕褐色的为阳性菌株。 选取活性相对较高的转化子，接种到50 mL BMGYC10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、13.4 g/L YNB,0.4 mg/L生物素、10 g/L甘油)，培养至0D6(l(l=2-3时，离心收集菌体，然后加入等体积BMMY诱导48 h，其间每隔24 h补加甲醇至终浓度lwt%。表达的目的蛋白分泌在上清液中，因此诱导完成后，12000 rpm，离心10 min收集上清。分析得到蛋白质的表达量为0.017 mg/mLo 实施例2 ClLACI漆酶的性质测定分析过程是在下本文档来自技高网...

【技术保护点】
漆酶ClLACI序列，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。

【技术特征摘要】
1.漆酶ClLACI序列，其核苷酸序列如SEQID No I所示。2.根据权利要求1所述的漆酶ClLACI序列，其特征在于，其编码的蛋白质序列如SEQID No 2所示。3.包括权利要求1所述的漆酶ClLACI序列的PPIC9K-C1LACI载体。4.权利要求3所述的PPIC9K-C1LACI载体用于毕赤酵母...

【专利技术属性】
技术研发人员：王波，姚泉洪，彭日荷，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，
类型：发明
国别省市：上海;31