一种鳕鱼皮胶原蛋白源螯合肽及其制备方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种鳕鱼皮胶原蛋白源螯合肽及其制备方法，本发明专利技术的鳕鱼皮胶原蛋白源螯合肽的制备方法，包括有胶原蛋白酶解物的制备和金属螯合肽的分离制备步骤。本方法以二甲基亚砜替代水作为反应介质，然后在此无水体系中对交联琼脂糖进行活化，有效抑制了活化过程中的水解反应，该体系中环氧氯丙烷对交联琼脂糖凝胶的活化效率大幅度提高，环氧基活化密度范围为157-165μmol/mL，较目前报道的最高值提高50％，进而获得了高配基密度和对蛋白质具有高载量的固定化金属亲和层析介质。采用本方法制备的螯合肽对金属离子的结合能力强，稳定性好，螯合活性大于0.5mmol/g。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于食品加工
，具体一种鳕鱼皮胶原蛋白源螯合肽及其制备方 法。
技术介绍
螯合肽是指来源于食源性蛋白，具有一定的矿物质元素螯合能力或者在消化吸收 过程中能发挥潜在的促矿物质元素吸收和提高矿物质元素生物利用度的一类多肽。矿物质 钙、锌、铁和铜在人体内拥有各种各样的生物功能。饮食中矿物质元素缺乏可能导致各种各 样的疾病进而影响身体机能。 营养学家建议在日常饮食中食用富含矿物质元素和有促矿物质吸收功能的食物。 从健康和饮食偏好的角度考虑，食源营养补充剂更易被人们接受。食源性矿物质元素补充 剂更是在近些年成为研究的热点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，即一种从鳕鱼 皮胶原蛋白肽中分离制备的，具有螯合钙、铁和铜能力的蛋白肽。 本专利技术的鳕鱼皮胶原蛋白源螯合肽的制备方法，包括如下的步骤： 1)胶原蛋白酶解物的制备： 在鳕鱼皮胶原蛋白水溶液中加入胰蛋白酶进行水解，水解结束后使胰蛋白酶失 活，离心得到上清液备用； 其中胶原蛋白水溶液的浓度为0. 5 % -5 % (w/v)，胰蛋白酶在水溶液中的浓度为 2% -5% (w/w)； 2)金属螯合肽的分离制备： 将步骤1)的上清液加入到固定化金属亲和层析柱中进行结合，然后用PH7. 6的去 离子水进行清洗，再用PH为3. 0的盐酸溶液将结合在固定化金属亲和层析柱上的螯合肽洗 脱下来；收集洗脱液，真空旋转蒸发去除盐酸后获得鳕鱼皮胶原蛋白螯合肽； 其中盐酸溶液的浓度为〇· 5-1. 5mol/L ; 固定化金属亲和层析柱的制备步骤如下：在以二甲基亚砜溶剂中将环氧氯丙烷活 化的琼脂糖凝胶Sepharose 6B与亚氨基二乙酸在50-80°C下交联5-10小时，制备亲和层析 柱基质；再分别将3-5个柱体积的0. 1-0. 5mol/L的金属离子溶液与柱内基质充分结合2-5 小时，再用去离子水洗去未结合的金属离子，固定化金属亲和层析柱。 其中金属离子溶液为CaCl2、ZnSO4、FeSO4或CuSO 4溶液。 本方法以二甲基亚砜替代水作为反应介质，然后在此无水体系中对交联琼脂糖进 行活化，有效抑制了活化过程中的水解反应，该体系中环氧氯丙烷对交联琼脂糖凝胶的活 化效率大幅度提高，环氧基活化密度范围为157-165 μ mol/mL，较目前报道的最高值提高 50 %，进而获得了高配基密度和对蛋白质具有高载量的固定化金属亲和层析介质。采用本 方法制备的螯合肽对金属离子的结合能力强，稳定性好，螯合活性大于0. 5mmol/g。 【附图说明】 图1 :胶原蛋白肽的固定化金属亲和层析纯化图。 【具体实施方式】 本专利技术通过胰酶水解鳕鱼皮胶原、固定化金属亲和层析分离获得了螯合肽。 实施例1 1)胶原蛋白酶解物的制备： 将鳕鱼皮胶原蛋白溶于蒸馏水中（1:50, w/v)，用NaOH调整pH至7. 5,然后在37°C 预热10分钟，向上述反应液中加入胰蛋白酶（1:25, w/w)水解15分钟，其中胰酶的酶活 4X 105u/g，然后KKTC沸水浴中灭酶10分钟，4000rpm离心10分钟，上清液冻干。 相同条件下，对比胰蛋白酶、碱性蛋白酶Alcalase和木瓜蛋白酶的水解效果，胰 蛋白酶的水解效果最好，胰蛋白酶水解物的金属螯合活性分别为碱性蛋白酶Alcalase水 解物的1. 2倍、为木瓜蛋白酶水解物的1. 5倍。 2)固定化金属亲和层析柱（IMAC)的制备 将琼脂糖凝胶S印harose 6B用蒸馏水反复洗涤除去乙醇后，与60% (v/v)的二 甲基亚砜水溶液（即无水体系）混合，搅拌清洗lOmin。称取处理后的琼脂糖凝胶，与定量 二甲基亚砜、环氧氯丙烷、水、NaOH混合。混合液于45°C恒温振荡器中反应3h。将处理后 的混合液用大量去离子水洗涤至无环氧基检出。环氧氯丙烷活化的琼脂糖凝胶Sepharose 6B与亚氨基二乙酸（3:10, w/v)在60°C下交联8小时，制备亲和层析柱基质。然后分别将 5个柱体积的0. 2mol/L CaCl2、ZnS04、FeS04和CuSO4溶液与柱内基质充分结合2小时，再以 5个柱体积的去离子水洗去未结合的金属离子，制成钙、锌、铁和铜固定化金属亲和层析柱。 相对于其他螯合肽分离纯化方法，固定化金属亲和层析法的优势主要体现在：洗 脱条件温和（本方法pH为7. 6)条件下；再生后配体恢复完全，琼脂糖凝胶S印harose 6B 可再生几百次而不改变其层析特性；螯合肽洗脱容易，采用较低pH (pH为3. 0)便可将吸附 螯合肽解吸下来。 3)固定化金属亲和层析柱对螯合肽的富集：取2mL胶原蛋白酶解物水溶液（pH 7. 6，15mg/mL)，加入固定化金属亲和层析柱中。用pH 7. 6的去离子水以lmL/min速度洗脱 未与固定化的金属离子结合的多肽，紫外检测器检测214nm吸光值，充分洗脱直至无214nm 吸收。结合在固定化的金属亲和层析柱上的肽用lmol/L的HCl (pH 3.0)洗脱下来，收集 洗脱液，反复真空旋转蒸发去除HC1，得到胶原蛋白金属螯合肽。采用固定化金属亲和层析 柱可以去除没有螯合活性的多肽，对钙、锌、铁和铜的螯合肽进行富集纯化。本方法共鉴定 出11条矿物质螯合肽，即钙螯合肽WR、SGSTGH和GPAGPHGPPG，锌螯合肽NI/LGER、GPAGPR、 AGPAGPR、VGLIGPR 和 NGPAGPR，铁螯合肽 SCH、GPAGPHGPPG，和铜螯合肽 SAC、GPAGPHGPPG 和 GPVGPHGPPGKDG。 4)铁螯合活性 胶原蛋白螯合肽（250 μ L，lmg/mL)溶解在缓冲液（0. 05mol/L醋酸钠 ，pH 5. 0)中 后加到96孔板内在酶标仪（BioTek Instrumentslnc. , VT，USA)内37°C预热5分钟，加入 20 μ L 的 0· 25mmol/L FeS0430 分钟后，加入 15 μ L 的 2. 5mmol/L 的 ferrozine 来终止反应。 10分钟后测定562nm处的吸光度值。以去离子水代替样品作为空白对照。酪蛋白磷酸肽 用作正相对照。铁螯合率（％ ) = (Absse-Abs#s)Absse X 100%。螯合肽的铁鏊合率为 21. 5±1. 03%。 5)胶原蛋白螯合肽铜螯合活性 20(^1^胶原蛋白螯合肽（10(^8/1^，0.05111〇1/1醋酸钠，？!15.0)加到96孔板，在 37°C预热5分钟，然后加入20 μ L的CuS04(lmg/mL)。30分钟后，加入10 μ L(2mmol/L)的 PV终止反应，在632nm处测吸光度值。以去离子水代替样品作为空白对照。酪蛋白磷酸肽 用作正相对照。铜螯合率（％) = (Absee-Abs^J/AbseeXlOO1%。螯合肽的铜鏊合率 为 8. 45±0· 25%。 6)钙螯合活性 4mL胶原蛋白螯合肽（0· 75mg/mL, 20mmol/L磷酸钠缓冲液溶解，pH 7. 5,），加入 2mL CaC12 (5mmol/L)，在37°C孵育30分钟。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鳕鱼皮胶原蛋白源螯合肽的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)胶原蛋白酶解物的制备：在鳕鱼皮胶原蛋白水溶液中加入胰蛋白酶进行水解，水解结束后使胰蛋白酶失活，离心得到上清液备用；2)金属螯合肽的分离制备：将步骤1)的上清液加入到固定化金属亲和层析柱中进行结合，然后用pH7.6的去离子水进行清洗，再用pH为3.0的盐酸溶液将结合在固定化金属亲和层析柱上的螯合肽洗脱下来；收集洗脱液，真空旋转蒸发去除盐酸后获得鳕鱼皮胶原蛋白螯合肽。

【技术特征摘要】
1. 一种鳕鱼皮胶原蛋白源螯合肽的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步 骤： 1) 月父原蛋白酶解物的制备： 在鳕鱼皮胶原蛋白水溶液中加入胰蛋白酶进行水解，水解结束后使胰蛋白酶失活，离 心得到上清液备用； 2) 金属螯合肽的分离制备： 将步骤1)的上清液加入到固定化金属亲和层析柱中进行结合，然后用PH7. 6的去离子 水进行清洗，再用pH为3. 0的盐酸溶液将结合在固定化金属亲和层析柱上的螯合肽洗脱下 来；收集洗脱液，真空旋转蒸发去除盐酸后获得鳕鱼皮胶原蛋白螯合肽。2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤1)中胶原蛋白水溶液的浓度 为om3. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的步骤1)中胰蛋白酶在水溶液中的 浓度为2% -5%。4. 如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：李八方，侯虎，郭立冬，赵雪，张朝辉，彭喆，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37