一种苯硼酸材料富集糖肽的方法技术

本发明专利技术公开了一种苯硼酸材料富集糖肽富集方法。本方法使用具有苯硼酸修饰的硅球作为富集材料，通过优化有机溶剂的种类和浓度、缓冲盐类型和浓度，富集温度等参数，实现了对糖肽的选择性富集。该方法具有选择性高、吸附量大、操作简便可控等特点，适用于生物样品中糖肽的选择性富集。

【技术实现步骤摘要】
一种苯硼酸材料富集糖肽的方法
本专利技术属于分离与纯化
，具体涉及一种糖肽富集方法。技术背景蛋白质的糖基化修饰参与真核细胞许多重要的调节过程，包括受体激活、信号转导以及细胞吞噬等[OhtsuboandMarth,Cell,2006]。许多疾病的发生与蛋白质糖基化的变异有关，比如恶性肿瘤[Wang,etal.,Glycobiology2006]、风湿性关节炎[Fournier,etal.BiochimicaEtBiophysicaActa-ProteinStructureandMolecularEnzymology,2000)慢性阻碍性肺部疾病[Nihlen,etal.,ScandinavianJournalofClinical&LaboratoryInvestigation,2001]、以及阿尔茨海默病等[vanRensburg,etal.,MetabolicBrainDisease,2004]。由此，对糖蛋白的结构进行表征非常重要。但是，在糖蛋白中糖基化位点表达的化学计量位点相对比较低；另外酶解液中糖肽数量比较少，导致在质谱检测时糖肽信号强度比较低；因此，在对酶解液进行质谱分析前，需要对糖肽进行富集[Temporini,etal.,MassSpectrometryReviews,2008]。目前，发展了许多富集糖肽的策略包括凝集素亲和色谱法、肼化学法、硼酸亲和色谱法及亲水作用色谱法等。凝集素亲和作用色谱被广泛应用在分离和富集糖蛋白和糖肽中[Dalziel,etal.1999]。但存在糖基化覆盖率低的问题[Kubota,etal.Anal.Chem.2008]；肼化学对糖肽的选择性高，但是该方法存在丢失糖链的信息的问题[Zhang,H.;etal.Nat.Biotechnol.2003.]；亲水作用色谱对不同的糖链结构有保留，在糖肽富集的行列中表现出很好的效果，糖基化覆盖率高。但是该方法容易受到极性非糖肽的干扰[Wada,Y.;etal.Anal.Chem.2004.]。硼酸亲和色谱法能与顺势二醇形成硼酸酯结构也可以用来富集糖肽[Zhou,W.;etal.Chem.Commun.2008]。该方法通常在碱性缓冲盐体系下进行富集。但非糖肽与硼酸材料之间存在的氢键作用降低了该方法的选择性。降低或消除硼酸材料与非糖肽之间的氢键作用，同时增强糖肽与硼酸材料之间的作用对提高硼酸材料对糖肽的选择性是非常必要的。
技术实现思路
本专利技术涉及一种苯硼酸材料富集糖肽的方法。本方法使用具有苯硼酸修饰的硅球作为富集材料，通过优化有机溶剂的种类和浓度、缓冲盐类型和浓度，富集温度等参数，实现了对糖肽的选择性富集。本方法涉及的色谱模式为亲水作用色谱和亲和作用色谱原理。本专利技术的目的在于提供一种具有高选择性、糖基化覆盖率广和操作简单的糖肽富集方法，能对痕量糖肽进行选择性富集。一种苯硼酸材料富集糖肽富集方法，其特征在于：以苯硼酸修饰的硅球为富集材料，进行固相萃取（SPE），于肽样品中富集分离出糖肽。富集材料的粒径是2-50m,孔径为硅球上修饰的苯硼酸层数是单层或多层；所述单层为一分子苯硼酸通过连接基团结合到硅球上的一分子硅羟基上；所述多层为多分子苯硼酸通过聚合首尾相连结合到硅球上的一分子硅羟基上。所述富集分离的色谱模式为亲水作用色谱和亲和作用色谱原理；以苯硼酸修饰的硅球作为富集材料，使用固相萃取（SPE）技术，首先使富集材料与肽样品接触，然后冲洗富集材料去除其上的非糖肽，最后将富集材料上的糖肽洗脱下来；冲洗非糖肽的流动相组成包括水、有机溶剂和缓冲盐混合液，或水和有机溶剂混合液；洗脱糖肽的洗脱溶剂组成包括水或水和有机溶剂混合液。具体操作采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式；在柱固相萃取(SPE)模式下采用富集材料富集糖肽时，将肽样品上到填装有富集材料的SPE柱上，采用冲洗非糖肽的流动相冲洗富集材料去除其上的非糖肽，再采用洗脱溶剂冲洗，富集出糖肽；或在分散固相萃取模式下采用富集材料顺序富集磷酸肽时，将肽样品直接与富集材料混合，离心，采用冲洗非糖肽的流动相去除富集材料上的非糖肽；离心，采用洗脱溶剂冲洗富集材料上的，富集出糖肽。分散固相萃取模式下，肽样品与富集材料接触后需要孵化，孵化时间0.5-120分钟；冲洗非糖肽的流动相组成如下a-f任一之一所示：a.A相为水，B相为乙腈，体积比A/B:10/90-40/60。b.A相为水，B相为甲醇，体积比A/B:10/90-40/60。c.A相为碳酸氢铵水溶液，B相为乙腈，体积比A/B:5/95-40/60。d.A相为碳酸氢铵水溶液，B相为甲醇，体积比A/B:5/95-40/60。e.A相为磷酸氢二钾水溶液，B相为乙腈，体积比A/B:5/95-40/60。f.A相为磷酸氢二钾水溶液，B相为甲醇，体积比A/B:5/95-40/60。其中碳酸氢铵水溶液，浓度5-200mM，pH7.9；磷酸氢二钾水溶液，浓度5-200mM，pH7。洗脱糖肽的洗脱溶剂组成如下任一之一所示：a.A相为水，B相为乙腈，体积比A/B:50/50-99/1。b.A相为水，B相为甲醇，体积比A/B:50/50-99/1。c.A相为甲酸水溶液，B相为乙腈，体积比A/B:50/50-99/1。d.A相为甲酸水溶液，B相为甲醇，体积比A/B:50/50-99/1。e.A相为乙酸水溶液，B相为乙腈，体积比A/B:50/50-99/1。f.A相为水溶液，B相为甲醇，体积比A/B:50/50-99/1。其中甲酸水溶液，含量0.1-10%，pH1-4；其中乙酸水溶液，含量0.1-10%，pH1-4；肽样品的样品浓度为0.1ng/mL-1mg/mL；富集温度为15-60℃。所述肽样品为蛋白酶解液；所述蛋白为组织、细胞、血清、尿液等生物样品中的蛋白或者是糖蛋白标准品（转铁蛋白、胎球蛋白、辣根过氧化酶、核糖核酸酶B等）中的一种或二种以上混合；所述酶为胰蛋白酶、内肽酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶中的一种或二种以上混合。具体的制备步骤如下：具体操作时采用萃取模式模式，过程如下：1]将苯硼酸修饰硅胶装入萃取柱中，采用冲洗液平衡柱子，将肽样品旋干，溶解于1-200L含有90-10%乙腈/5-200mM碳酸氢铵缓冲盐到萃取柱上；2]采用2-50倍苯硼酸修饰硅胶材料柱体积的的90-10%乙腈/5-200碳酸氢铵缓冲盐淋洗溶液冲洗，去除非糖肽；重复此步骤1-10次；3]采用2-50倍9的0-50%乙腈[pH2-6)洗脱溶液洗脱糖肽。重复此步骤1-10次。具体操作时采用分散固相萃取模式，过程如下；1]将糖肽样品旋干，溶解于1-200L含有90-10%乙腈/5-200mM碳酸氢铵缓冲盐后，直接与苯硼酸修饰硅胶材料混合，孵化0.5-120分钟，离心，弃上层溶液，收集沉淀；2]离心后的苯硼酸修饰硅胶材料与2～50倍材料柱体积的含有90-10%乙腈/5-200mM碳酸氢铵缓冲盐混合孵化，孵化0.5-120分钟，离心，弃上层溶液，收集沉淀；重复此步骤1-10次；3]离心后的苯硼酸修饰硅胶材料与2～50倍材料柱体积的0-50%乙腈[pH2-6)洗脱溶液洗脱混合，孵化0.5-120分钟，离心，收集上清液，得到糖肽。重复此步骤1-10次。该方法具有选择性高、吸附量大、操作本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苯硼酸材料富集糖肽富集方法，其特征在于：以苯硼酸修饰的硅球为富集材料，进行固相萃取（SPE），于肽样品中富集分离出糖肽。

【技术特征摘要】
1.一种苯硼酸材料富集糖肽富集方法，其特征在于：在亲水作用色谱操作模式下，实现苯硼酸材料对糖肽的选择性富集；富集分离的色谱模式为亲水作用色谱和亲和作用色谱原理；以苯硼酸修饰的硅球作为富集材料，使用柱固相萃取（SPE）技术或分散固相萃取技术，冲洗非糖肽的流动相组成如下a-f任一之一所示：a．A相为水，B相为乙腈，体积比A/B:10/90-40/60；b．A相为水，B相为甲醇，体积比A/B:10/90-40/60；c．A相为碳酸氢铵水溶液，B相为乙腈，体积比A/B:5/95-40/60；d．A相为碳酸氢铵水溶液，B相为甲醇，体积比A/B:5/95-40/60；e．A相为磷酸氢二钾水溶液，B相为乙腈，体积比A/B:5/95-40/60；f．A相为磷酸氢二钾水溶液，B相为甲醇，体积比A/B:5/95-40/60。2.按照权利要求1所述方法，其特征在于：所述富集分离的色谱模式为亲水作用色谱和亲和作用色谱原理；以苯硼酸修饰的硅球作为富集材料，使用柱固相萃取（SPE）技术或分散固相萃取技术，首先使富集材料与肽样品接触，然后冲洗富集材料去除其上的非糖肽，最后将富集材料上的糖肽洗脱下来；洗脱糖肽的洗脱溶剂组成包括水或水和有机溶剂混合液。3.按照权利要求2所述方法，其特征在于：具体操作采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式；在柱固相萃取(SPE)模式下采用富集材料富集糖肽时，将肽样品上到填装有富集材料的SPE柱上，采用冲洗非糖肽的流动相冲洗富集材料去除其上的非糖肽，再采用洗脱溶剂冲洗，富集出糖肽；或在分散固相萃取模式下采用富集材料顺序富集糖肽时，将肽样品直接与富集材料混合，离心，采用冲洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁鑫淼，李秀玲，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21