一种牛皮明胶的定量检测方法，它是联合胞内蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶酶解牛皮明胶，采用HPLC-LTQOrbitrapMS鉴定牛皮明胶的特征性质谱峰，通过胰蛋白酶催化H218O对牛皮明胶酶解多肽进行标记，借助HPLC-LTQOrbitrapMS检测18O标记前后的特征峰峰面积，准确计算牛皮明胶添加量。本发明专利技术的有益效果：1、联合胞内蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶酶解牛皮明胶，可有效增强酶解效果，提高牛皮明胶特征峰的检出率；2、LTQOrbitrapMS具有非常高的分辨率，可保证定量检测的误差低于10%；3、利用胰蛋白酶催化18O标记和HPLC-LTQOrbitrapMS检测，能准确定量检测食品中的牛皮明胶添加量，可为相关部门监控食品提供依据。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】，它是联合胞内蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶酶解牛皮明胶，采用HPLC-LTQOrbitrapMS鉴定牛皮明胶的特征性质谱峰，通过胰蛋白酶催化H218O对牛皮明胶酶解多肽进行标记，借助HPLC-LTQOrbitrapMS检测18O标记前后的特征峰峰面积，准确计算牛皮明胶添加量。本专利技术的有益效果：1、联合胞内蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶酶解牛皮明胶，可有效增强酶解效果，提高牛皮明胶特征峰的检出率；2、LTQOrbitrapMS具有非常高的分辨率，可保证定量检测的误差低于10%；3、利用胰蛋白酶催化18O标记和HPLC-LTQOrbitrapMS检测，能准确定量检测食品中的牛皮明胶添加量，可为相关部门监控食品提供依据。【专利说明】
本专利技术涉及一种定量检测牛皮明胶的方法。
技术介绍
明胶具有凝胶性、乳化性、起泡性、成膜性等多种功能特性，被广泛应用于食品、医 药、照相等领域。目前，商业上大约95%的明胶来源于哺乳动物，如猪皮、牛皮。然而，疯牛 病的传播使得消费者对购买牛皮明胶的相关商品产生了一定顾虑，而且印度教徒不食用与 牛相关的食物，因此，需要寻找一种能够定量检测牛皮明胶的方法。 本专利技术联合胞内蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶酶解牛皮明胶，采用高效液相色谱-LTQ Orbitrap质谱（HPLC-LTQ Orbitrap MS)鉴定牛皮明胶的特征性质谱峰，通过胰蛋白酶催 化H218O对牛皮明胶酶解多肽进行标记，借助HPLC-LTQ Orbitrap MS得到的特征峰峰面积， 准确计算牛皮明胶添加量。本专利技术采用HPLC-LTQ Orbitrap MS和胰蛋白酶催化的18O标记 对牛皮明胶进行定量检测，国内外未有文献进行相关报道。
技术实现思路
本专利技术旨在提供，以牛皮明胶为对象，采用胞内蛋 白酶LyS-C和胰蛋白酶酶解、胰蛋白酶催化18O标记、HPLC-LTQ Orbitrap MS检测，有效确 定食品中牛皮明胶的添加量。 其具体工艺方案如下： 1、牛皮明胶酶解 (1) 加入碳酸氢氨溶液配制牛皮明胶溶液：用10-100 mM的碳酸氢氨溶液溶解得到 0? 1-10 mg/ml的牛皮明胶溶液； (2) 加入胞内蛋白酶Lys-C，使牛皮明胶酶解：胞内蛋白酶和牛皮明胶质量比mg/mg为 1:200-1:10,酶解温度为20-50 °C，反应时间为1-24 h; (3) 加入胰蛋白酶使牛皮明胶酶解：胰蛋白酶和牛皮明胶质量比mg/mg为 1:200-1:10,酶解温度为15-50 °C，反应时间为4-30 h。 2、同位素标记 (1) 加酶：将胰蛋白酶加入经胞内蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶酶解的牛皮明胶水解物中， 胰蛋白酶和牛皮明胶质量比mg/mg为1:100-1:1 ; (2) 冻干：冻干温度为-30至-80°C，冻干时间为2-24h; (3) 进一步去除水分：加入20-200 色谱乙腈，常温下真空干燥10-60min去除残余 的水分和乙腈； (4) 标记：一份牛皮明胶酶解物中加入H216O,另一份牛皮明胶酶解物中加入H2 18O,进 行标记，H216O或H218O与牛皮明胶酶解物的质量比mg/mg为10:1-100:1，标记所需温度为 10-60°C，时间为 3-48h。 3、HPLC-LTQ Orbitrap MS 检测 (1) 将标记物和未标记物混合：以H218O标记的牛皮明胶水解物为内标，与H2 16O标记的 牛皮明胶水解物按照1:50-50:1混合； (2) 上样检测：将混合样品注射进入HPLC-LTQ Orbitrap MS设备，检测牛皮明胶酶解 物中H216O标记的特征峰和H218O标记的特征峰，上样量为0. 5-20 ii g。 4、数据分析 (1) 根据氨基酸序列，寻找牛皮明胶的特征峰； (2) 分析并记录特征峰在标记前后的峰面积； (3) 定量方法的准确性分析，即通过比较标记物/未标记物即180/160的计算值与实际 混合比例检验定量方法的准确性，18CV16O按照如下公式计算： 【权利要求】1. ，其特征是： A、 牛皮明胶酶解 (1) 加入碳酸氢氨溶液配制牛皮明胶溶液； (2) 加入胞内蛋白酶Lys-C，使牛皮明胶酶解； (3) 再加入胰蛋白酶使牛皮明胶酶解； B、 同位素标记 (1) 加酶：将胰蛋白酶加入经胞内蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶酶解的牛皮明胶水解物 中； (2) 冻干； (3) 进一步去除水分； (4) 标记：一份牛皮明胶酶解物中加入H216O,另一份牛皮明胶酶解物中加入H2 18O,进行 标记； C、 HPLC-LTQ Orbitrap MS 检测 (1) 将标记物和未标记物混合； (2) 上样检测：将混合样品注射进入HPLC-LTQ Orbitrap MS设备，检测牛皮明胶酶解 物中H216O标记的特征峰和H218O标记的特征峰，上样量为0. 5-20 g ; D、 数据分析 (1) 根据氨基酸序列，寻找牛皮明胶的特征峰； (2) 分析并记录特征峰在标记前后的峰面积； (3) 定量方法的准确性分析，即通过比较标记物/未标记物即180/160的计算值与实际 混合比例检验定量方法的准确性，18CV16O按照如下公式计算：其中，Itl, I2和I4分别代表未标记即16O的特征肽在实验中测得的单一同位素峰面积， 质量高2Da的峰面积和质量高4Da的峰面积；Mtl, M2和M4分别代表未标记即16O的特征肽 在理论上的单一同位素峰面积，质量高2Da的峰面积和质量高4Da的峰面积。2. 根据权利要求1所述的，其特征是： 所述牛皮明胶溶液的配比中加入10 mM的碳酸氢氨溶液溶解得到I mg/ml的牛皮明胶 溶液； 所述加入胞内蛋白酶酶解时，胞内蛋白酶与牛皮明胶质量比mg/mg为1:100,酶解温 度为37 °C，反应时间为4 h; 所述再加入胰蛋白酶酶解时，胰蛋白酶和牛皮明胶质量比mg/mg为1:50,酶解温度为 37 °C，反应时间为12 h。3. 根据权利要求1所述的，其特征是： 所述同位素标记中胰蛋白酶和牛皮明胶质量比为1:100-1:1 ; 所述冻干温度为-30至_80°C，冻干时间为2-24h; 所述进一步去除水分的条件是：加入20-200 iU色谱乙腈，常温下真空干燥 l〇-60min ； 所述标记中H216O或H218O与牛皮明胶酶解物的质量比为10:1-100:1，标记所需温度为 10-60°C，时间为 3-48h。4. 根据权利要求1、2或3所述的，其特征在 于：未标记时，胞内蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶处理后的牛皮明胶酶解物中特征峰为 591. 79742-591. 83742+，相应的氨基酸序列为EGPVGL*PGIDGR，其中*表示P被羟基化，经18O 标记后，特征峰的质荷比变成59 3 . 79 742+_59 3 . 8 3 742+'氨基酸序列EGPVGL*PGIDGR中R的羧 基末端两个16O原子被18O代替。5. 根据权利要求1、2或3所述的，其特征在 于：未标记时，胞内蛋白酶Lys-C和胰蛋白酶处理后的牛皮明胶酶解物中特征峰为 634. 32972-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种牛皮明胶的定量检测方法，其特征是：A、牛皮明胶酶解（1）加入碳酸氢氨溶液配制牛皮明胶溶液；（2）加入胞内蛋白酶 Lys‑C，使牛皮明胶酶解；（3）再加入胰蛋白酶使牛皮明胶酶解；B、同位素标记（1）加酶：将胰蛋白酶加入经胞内蛋白酶 Lys‑C和胰蛋白酶酶解的牛皮明胶水解物中；（2）冻干;（3）进一步去除水分；（4）标记：一份牛皮明胶酶解物中加入H216O，另一份牛皮明胶酶解物中加入H218O，进行标记； C、HPLC‑LTQ Orbitrap MS检测（1）将标记物和未标记物混合；（2）上样检测：将混合样品注射进入HPLC‑LTQ Orbitrap MS设备，检测牛皮明胶酶解物中H216O标记的特征峰和H218O标记的特征峰，上样量为0.5‑20μg；D、数据分析（1）根据氨基酸序列，寻找牛皮明胶的特征峰；（2）分析并记录特征峰在标记前后的峰面积；（3）定量方法的准确性分析，即通过比较标记物/未标记物即18O/16O的计算值与实际混合比例检验定量方法的准确性，18O/16O按照如下公式计算：其中，I0, I2 和 I4分别代表未标记即16O的特征肽在实验中测得的单一同位素峰面积，质量高2Da的峰面积和质量高4Da的峰面积；M0, M2 和 M4分别代表未标记即16O的特征肽在理论上的单一同位素峰面积，质量高2Da的峰面积和质量高4Da的峰面积。...
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：涂宗财，沙小梅，肖辉，王辉，段邓乐，陈媛，刘光宪，
申请(专利权)人：江西师范大学，
类型：发明
国别省市：江西;36
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