疏花水柏枝愈伤组织和悬浮细胞颗粒的培养方法技术

本发明专利技术涉及一种植物组织和细胞的培养方法，以三峡流域特有的珍稀濒危植物疏花水柏枝（Myricarialaxiflora）茎段为外植体，涉及愈伤组织和优良悬浮细胞颗粒的规模化生产方法，属于植物组织或细胞培养领域。本发明专利技术公开了愈伤组织和悬浮细胞颗粒的培养方法，包括：1.得到无菌的疏花水柏枝植物体器官，比较得到体系根，茎，叶中全能性最为突出的部位；2.将无菌的茎段接种到愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导和继代培养，得到以疏花水柏枝组织为原料的愈伤组织；3.将愈伤组织接种到相应的液体培养基中振荡培养，得到以疏花水柏枝器官为起源的性状稳定的悬浮细胞颗粒。本发明专利技术得到的愈伤组织性状稳定，得到的悬浮细胞颗粒生长速度快，分散性好，细胞团较小，溶液澄清透明。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物组织或细胞的培养方法，涉及以疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）茎段为植物器官起源的愈伤组织和优良悬浮细胞颗粒的规模化生产方法，属于植物组织或细胞培养领域。 
技术介绍
疏花水柏枝系柽柳科（Tamaricaceae）水柏枝属（Myricaria）多年生灌木，限制性地分布于三峡库区长江两岸自然消落地带中部和下部沙滩地，海拔高度约为80～155 m，是唯一因三峡工程被列为中国珍稀濒危植物的植物物种。水柏枝属植物主要具有疏风解表、祛风通络的功能，主治麻疹不透，风湿痹痛，癣等，含有多种有效中药化学成分如黄酮类化合物、槲皮苷、山柰酚、槲皮素、柯伊利素、没食子酸、没食子酸乙脂、谷甾醇、胡萝卜苷[13]。疏花水柏枝为唯一的低海拔种类，可用于治疗烫伤，耐受洪水冲击，耐沙土掩埋和耐干旱等极端气候环境。 疏花水柏枝为天然资源，由于其生存环境恶劣，一年中有3-6个月处于淹水胁迫中，而且其生长缓慢，周期性长，三峡工程修建丧失其全部原生生境而濒临灭绝。因此人们尝试通过各种途径来解决对疏花水柏枝的需求问题以及生态保护。疏花水柏枝组织培养可以克服野生资源短缺、自然繁殖率底和人工栽培繁琐且成功率低的问题。悬浮细胞培养直接由无菌的植物组织得来，培养周期短，重复性好，能得到大量的疏花水柏枝次生代谢产物。 目前，疏花水柏枝的研究主要集中在其生态环境，生理变化，扦插和种子繁殖方向，并不能解决水柏枝属植物资源匮乏的现状。尚未有学者报道疏花水柏枝愈伤组织诱导和悬浮细胞培养体系的建立。 
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种疏花水柏枝愈伤组织诱导和悬浮细胞颗粒的培养方法，通过对疏花水柏枝茎段培养获得愈伤组织，进而获得优良的悬浮细胞体系具有生长速度快，分散性好等优点。 本专利技术所述的植物组织是以疏花水柏枝茎段为原料，经不同激素配比得到性状稳定的愈伤组织和悬浮细胞。 本专利技术的愈伤组织和悬浮细胞是通过以下技术方案来实现的，包括的步骤有： 1.得到无菌的疏花水柏枝植物体器官，比较得到体系根，茎，叶中全能性最为突出的部位，以及最适应的培养条件；2.将无菌的茎段接种到愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织的诱导和继代培养，得到以疏花水柏枝组织为原料的愈伤组织；3.将愈伤组织接种到相应的液体培养基中振荡培养，得到以疏花水柏枝器官为起源的性状稳定的悬浮细胞颗粒。其中，步骤1中得到无菌的疏花水柏枝植物体器官，以及筛选合适的外植体和培养条件可以参照如下方法得到： （1）采集回来的当年生疏花水柏枝嫩枝条先用自来水冲洗2-3遍，然后用酒精泡过的脱脂棉擦洗两遍，再用消毒过的镊子取要用的嫩叶或者茎段置于干净的培养皿中，在超净工作台上进行灭菌。灭菌方式为先用75%的乙醇浸泡，再用有效氯为3%的次氯酸钠浸泡，最后用无菌水漂洗4-5次，随后接种于MS培养基中。优选的杀菌时间为75%乙醇30s，3%的次氯酸钠2min。（2）将经灭菌处理后的带腋芽的茎段，嫩芽，叶分别接种于附加植物生长剂的MS培养基中，每种外植体处理接种三个平板，每个平板上接种十个外植体，培养筛选出合适的外植体。优选的最合适外植体为当年生的嫩茎段。 （3）将经灭菌处理后的带腋芽的茎段分别接种于含PVP(500 mg/L)，没食子酸（50 mg/L），Vc(10 mg/L)+半胱氨酸（100 mg/L）的抗氧化剂且附加了植物生长剂的MS培养基中，每组接种三个平板，每个平板上接种十个茎段，培养观察被氧化的数量，筛选出效果最明显的抗氧化剂。优选的抗氧化剂为500mg/L的PVP。 （4）将经灭菌处理后的带腋芽的茎段分别接种于MS，B5，N6培养基中，每个接种三个平板，每个平板上接种十个茎段，每七天记录一次芽生长情况，筛选出适合的基本培养基。优选的培养基为MS培养基。 本专利技术中以疏花水柏枝茎段为起源的愈伤组织和悬浮细胞的培养方法中，步骤2中所述的愈伤组织的优选过程如下方法得到： 将经灭菌处理后的带腋芽的茎段接种于MS培养基中振荡培养，加入PVP 500 mg/l,蔗糖30g/L，琼脂7.0g/L。设计具有浓度梯度的6-BA，和2，4-D，每个接种三个平板，每个平板上接种十个茎段，培养筛选出适合的激素浓度，振荡装置旋转式摇床转速为120r/min。不同激素配比优化设计如下：表1 激素对愈伤组织诱导的实验设计（浓度mg/L）处理编号6-BA2,4-D处理编号6-BA2,4-D10.25090.75020.250.2100.750.230.250.4110.750.440.250.6120.750.650.50131.0060.50.2141.00.270.50.4151.00.480.50.6161.00.6优选的激素浓度为6-BA 0.5mg/L，2，4-D 0.2mg/L；在激素浓度为6-BA 0.5mg/L，2，4-D 0.2mg/L情况下，分别选用90 r/min旋转式摇床、120 r/min旋转式摇床、140 r/min旋转式摇床，分别进行振荡培养，其中120 r/min旋转式摇床可培养出疏花水柏枝组织为原料的愈伤组织，90 r/min旋转式摇床、140 r/min旋转式摇床无法培养出疏花水柏枝组织为原料的愈伤组织。步骤3中所述的培养疏花水柏枝悬浮细胞的液体培养基的优选为如下的组成： MS基本培养基 + 蔗糖30g/L +琼脂7.0g/L + PVP 500 mg/l + 6-BA 0.5mg/L + 2，4-D 0.2mg/L；  本专利技术中疏花水柏枝茎段为器官起源的愈伤组织和悬浮细胞的培养中所用的培养基灭菌方式为121℃下灭菌20min，培养基的pH值为5.9-6.1。本专利技术中疏花水柏枝茎段为器官起源的愈伤组织和悬浮细胞的培养方法中培养条件优选为：培养温度25℃，光照周期为14h/d，光照强度采取分段控制：早上7:00-8:00，光照强度为1；8:00-9:00，光照强度为2；9:00-19:00，光照强度为3；19:00-20:00，光照强度为2；20:00-21:00，光照强度为3（其中光照强度1：3500Lx，光照强度2：6000Lx，光照强度3：8000Lx），光照周期及光照强度的选择对疏花水柏枝愈伤组织和悬浮细胞的培养的影响巨大。 目前尚未有对疏花水柏枝愈伤组织和悬浮细胞培养的报道，适宜的外植体、激素水平、继代次数以及愈伤组织的疏松程度是疏花水柏枝悬浮细胞培养体系建立所必需的。本专利技术对愈伤组织诱导培养过程中的表面消毒方法，外植体，抗氧化剂和激素配比进行了筛选和优化，可以在接种外植体15天后开始长出白色，疏松的愈伤组织，在30天内可以长满整个茎段，在MS固体培养基上存放2-3个月，并通过该愈伤组织建立了疏花水柏枝稳定的悬浮细胞培养体系，实验表明本法获得的悬浮细胞生长速度快（悬浮细胞的生长量3天便可增加一倍），分散性好，细胞团较小，均一性好，培养基澄清透明，为之后研究疏花水柏枝细胞产药研究提供了本体来源，有效的解决了原料不足问题以及降低了生产本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）植物愈伤组织和悬浮细胞颗粒的生产方法，包括以下步骤：（1）得到无菌的疏花水柏枝植物体器官，比较得到体系根、茎、叶中全能性最为突出的部位，以及最适应的培养条件；（2）将无菌的茎段接种到愈伤组织培养基中诱导培养15‑30天进行愈伤组织的诱导和继代培养，得到以疏花水柏枝组织为原料的愈伤组织，诱导培养基是MS基本培养基+蔗糖 30g/L+琼脂 7.0g/L+PVP 200‑500mg/L+6‑BA 0.3‑0.6mg/L+2,4‑D 0.1‑0.4mg/L，培养基的pH值为5.9‑6.1；（3）将愈伤组织接种到相应的液体培养基中振荡培养或低温培养，得到以疏花水柏枝器官为起源的性状稳定的悬浮细胞颗粒。

【技术特征摘要】
1.一种疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）植物愈伤组织和悬浮细胞颗粒的生产方法，包括以下步骤：
（1）得到无菌的疏花水柏枝植物体器官，比较得到体系根、茎、叶中全能性最为突出的部位，以及最适应的培养条件；（2）将无菌的茎段接种到愈伤组织培养基中诱导培养15-30天进行愈伤组织的诱导和继代培养，得到以疏花水柏枝组织为原料的愈伤组织，诱导培养基是MS基本培养基+蔗糖 30g/L+琼脂 7.0g/L+PVP 200-500mg/L+6-BA 0.3-0.6mg/L+2,4-D 0.1-0.4mg/L，培养基的pH值为5.9-6.1；（3）将愈伤组织接种到相应的液体培养基中振荡培养或低温培养，得到以疏花水柏枝器官为起源的性状稳定的悬浮细胞颗粒。
2.根据权利要求1所述的一种疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）植物愈伤组织和悬浮细胞颗粒的生产方法，其特征在于：步骤（1）所述无菌的疏花水柏枝植物体器官表面消毒方法为75%乙醇30s-2 min，3%-30%NaClO 2min-5min，合适的外植体为疏花水柏枝茎段，适宜的培养基为MS培养基并加入200-500mg/L的PVP。
3.按权利要求1所述的一种疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）植物愈伤组织和悬浮细胞颗粒的生产方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘士平，曾文，薛艳红，孔玉珊，蒋维，秦王格格，
申请(专利权)人：三峡大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42