一种美国白蛾SUMO‑ABP‑dHC‑ Cecropin A融合蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种美国白蛾SUMO‑ABP‑dHC‑ Cecropin A融合蛋白及其应用，该美国白蛾SUMO‑ABP‑dHC‑ Cecropin A融合蛋白表达方法如下：构建pETSUMO‑ABP‑dHC‑ Cecropin A 表达载体，在大肠杆菌中表达，超声破碎后收集上清Ni

【技术实现步骤摘要】
—种美国白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种美国白蛾SUMO-ABP-dHC- CecropinA融合蛋白及其应用。
技术介绍
随着抗生素的大量应用，致病菌耐药性的产生和新生抗生素的筛选瓶颈使得抗生素的应用受到一定的制约。近年来的研究发现，抗菌肽(Antimicrobal peptides,AMPs)以其独特的作用机理和分子特性成为有望替代传统抗生素的理想药物。 要将抗菌肽应用到生产实践，还有许多问题亟待解决，其中最主要的问题就是如何大量获取，现阶段主要通过以下3种途径获得抗菌肽:(I)天然提取；(2)化学合成；(3)基因工程表达。虽然生物提取可为工农业生产提供便宜、安全、可靠的抗菌肽产品，而且最早研究与发现抗菌肽往往采用生物提取的方法，但由于抗菌肽在动植物体内含量极微，因而天然提取抗菌肽往往杂质较多、提取率较低、费时长、工艺复杂，因此成本相对较高，无法实现大规模生产，这也成为制约抗菌肽进入实际应用的最大障碍。化学合成的方法虽然在生产上行得通，但是运用于产业化并不现实，特别是费用昂贵、对长链肽合成的低效率和抗菌活性不稳定的问题，使得其应用受到限制，仍不及通过基因工程在体外表达的发展潜力。利用基因工程方法来生产抗菌肽是一条理想途径，通过对基因工程菌种、表达载体、表达条件、分离纯化条件、表达系统等的不断改造与优化，得到了大量不同种类有活性的重组抗菌肽。
技术实现思路
专利技术目的:针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种美国白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白，具有很好的抗菌活性。本专利技术的另一目的是提供上述美国白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白的应用。 技术方案:为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为:一种美国白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白，由以下步骤获得:O根据美国白蛾天蚕素A基因序列设计引物Al、A2，以美国白蛾DNA为模板进行PCR，将PCR产物割胶回收，回收产物用和历/^///酶切，SUMO载体只用历酶切，T4 DNA Ligase连接酶切后的载体和PCR产物，连接产物转化万.co7i toplO中，获得含Petsumo-ABP-dHC- Cecropin A重组菌株；挑选阳性重组菌株，扩大培养提取Petsumo-ABP-dHC- Cecropin A重组质粒,转化到大肠杆菌BL21 ； 2)1?了6浓度0.2 mmol/L，低温诱导含有重组载体pETSUMO-dHC- Cecropin A的大肠杆菌表达菌株BL21，20小时后4°C收菌，冰上超声破碎表达菌体，40C，13000g, 20min离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过Ni+-NTA柱洗去杂蛋白，收集目的多肽透析过滤除菌后保存；其中，美国白蛾天蚕素A基因序列如SEQ ID N0.1所示。 所述的美国白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白，所述的引物A1、A2序列分别为: Al 序列:5’ - CAGGTGGAAGATCTTTAAGAAAATCG-3’， A2 序列:5，- CCCAAGCTTTTATTTTCTTAATGCTTTTGC-3，；其中，Al的5’端具有泣W酶切位点，A2的5’端具有酶切位点。 所述的美国白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白，过Ni+-NTA柱洗去杂蛋白的步骤为:Binding Buffer平衡Ni+-NTA柱后，上样含可溶性重组多肽的上清,先用Washingbuffer洗去杂蛋白，再用不同浓度的咪唑Tis HCl洗脱，目的多肽在洗脱浓度为250 mmol/L Imidazole, 0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris HCl, pH 8.0 洗脱下来。 所述的美国白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白在抗真菌活性中的应用。 有益效果:与现有技术相比，本专利技术通过基因重组方法获得美国白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白，并在大肠杆菌中获得高效表达，目的多肽经过HPLC分析达到大95%的纯度，通过质谱分析，分子量与预测多肽分子量也吻合。经检测，多肽具有明显的抗真菌活性，所制备的目的多肽，其活性高、成本低。 【附图说明】 图1 是 pET-SUMO- ABP- dHC-Cecropin A 质粒图； 图 2 是融合多肽 SUMO-ABP- dHC-Cecropin A 37°C诱导表达 12% SDS-PAGE 图； 图 3 是融合多肽 SUMO-ABP- dHC-Cecropin A 纯化 12% SDS-PAGE 图； 图4是SUMO酶切SUMO标签并获得ABP- dHC-Cecropin A的4-20%梯度SDS-PAGE电泳图；图5是SUMO酶切SUMO标签并获得ABP- dHC-Cecropin A的质谱分析图；图6是表达的ABP- dHC-Cecropin A抗真菌抑菌圈图。 【具体实施方式】 下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的解释。 在本专利技术中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。以下实施例中使用的美国白蛾由徐州林业站提供。 实施例1 克隆 Cecropin A cDNA 1、提取美国白蛾总RNA。 应用RNA抽提试剂(TIANGEN)按照其操作手册提取美国白蛾蛹脂肪体的总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其纯度，大于95%，紫外分光光度计测定其浓度为720ng/^L，满足使用需求。 2、采用Transgen cDNA逆转录试剂盒转录为第一链cDNA。 I)引物设计:根据NCBI惜古比天蚕,家蚕及果蝇Cecropin A序列比对设计兼并引物: Cec-Al:5’ - ATGAATTTCNCAANAATNNTNTNCTTCGT -3’，Cec-A2:5’ - NTATTTNCNAANGNTTTTNCNGTACCCAG -3' 2)逆转录:在DEPC处理的1.5mL Eppendorf管中依次加入总RNA抽提物3 μ L，Oligo d (T)18 (0.5 μ g/ μ L)1 μ L, 2 X TS React1n Mix 10 μ L, DEPC 水 5 μ L，TransScriptRT/RI Enzyme Mix I μ L ;42°C孵育 30min, 85°C加热 5min 失活 TransScript RT。将得到的cDNA分装后-20°C保存。 3) PCR:利用逆转录所得模板进行PCR,体系为25 μ L, 10 μ mol/L上、下游引物(上游引物:5’ - ATGAATTTCTCAAGAATTTTATTCTTC-3’，下游引物:5’ - TTATTTTCCT AATGCTTTTGCGGTAC-3，)各 I μ L，2.5mmol/L dN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种美国白蛾SUMO‑ABP‑dHC‑ Cecropin A融合蛋白，其特征在于，由以下步骤获得：1）根据美国白蛾天蚕素A基因序列设计引物A1、A2，以美国白蛾DNA为模板进行PCR，将PCR产物割胶回收，回收产物用Stu1和HindⅢ酶切，SUMO载体只用HindⅢ酶切，T4 DNA Ligase连接酶切后的载体和PCR产物，连接产物转化E.coli top10中，获得含Petsumo‑ABP‑dHC‑ Cecropin A重组菌株；挑选阳性重组菌株，扩大培养提取Petsumo‑ABP‑dHC‑ Cecropin A重组质粒，转化到大肠杆菌BL21；2）IPTG浓度0.2 mmol/L，低温诱导含有重组载体pETSUMO‑dHC‑ Cecropin A的大肠杆菌表达菌株BL21，20小时后4℃收菌，冰上超声破碎表达菌体，4℃，13000g，20min离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过Ni+‑NTA柱洗去杂蛋白，收集目的多肽透析过滤除菌后保存；其中，美国白蛾天蚕素A基因序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种美国白蛾SUMO-ABP-dHC- Cecropin A融合蛋白，其特征在于，由以下步骤获得: O根据美国白蛾天蚕素A基因序列设计引物Al、A2，以美国白蛾DNA为模板进行PCR，将PCR产物割胶回收，回收产物用和历/^///酶切，SUMO载体只用历酶切，T4 DNA Ligase连接酶切后的载体和PCR产物，连接产物转化万.co7i toplO中，获得含Petsumo-ABP-dHC- Cecropin A重组菌株；挑选阳性重组菌株，扩大培养提取Petsumo-ABP-dHC- Cecropin A重组质粒,转化到大肠杆菌BL21 ； 2)1?了6浓度0.2 mmol/L，低温诱导含有重组载体pETSUMO-dHC- Cecropin A的大肠杆菌表达菌株BL21，20小时后4°C收菌，冰上超声破碎表达菌体，40C，13000g, 20min离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过Ni+-NTA柱洗去杂蛋白，收集目的多肽透析过滤除菌后保存； 其中，美国白蛾天蚕素A基因序列如SEQ ID N0.1所示。2.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：诸葛强，张嘉鑫，武小龙，王晓立，潘惠新，尹佟明，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32