本发明专利技术公开了重组蛋白HarpinZΔ89-124的应用。本发明专利技术获得了一个HarpinZPsgS1蛋白的功能片段HarpinZΔ89-124，该蛋白能够在大肠杆菌体内稳定表达，并且在植物上具有比全长HarpinZPsgS1更好的生物学效应，同浓度的两个蛋白处理烟草、水稻后，HarpinZΔ89-124对烟草抗花叶病毒病效果、水稻根部促生长效果、水稻抗白叶枯病效果都显著高于全长HarpinZPsgS1，因此能在提高烟草抗烟草花叶病毒病效果、提高水稻抗白叶枯病效果、促进水稻生长中应用。
【技术实现步骤摘要】
重组蛋白HarpinZA89_124的应用
本专利技术属于基因工程领域,涉及重组蛋白HarpinZA89_124的应用。
技术介绍
Harpin蛋白是由植物病原细菌产生的一类蛋白质激发子，可以激发非寄主植物产 生过敏性细胞死亡（(hypersensitive cell death, HCD)，诱导植物产生防卫反应，促进植 物生长。Harpin蛋白的这些有益效应，可能是通过蛋白质不同的功能域实现的，因此分离、 鉴定Harpin蛋白中与抗病、促生有关的功能区域至关重要。 在丁香假单胞菌属中，对于菜豆致病变种P. syringae pv. phaseolicola功能域的 研究最透彻，认为C-末端对其功能行使至关重要（M. Haapalainen et al, 2011)，但其中对 功能域的研究仅仅局限于理化性质研究，如多肽结合位点，原生质膜脂类结合部位及孔洞 的形成等方面，缺乏对植物促生抗病方面的研究。因此，研究Harpin蛋白中与植物抗病、 促生等在植物上的有益效应相关的功能区域具有重要意义，为harpin蛋白在农业生产中 的应用提供基础。本实验室前期已经从丁香假单胞大豆致病变种（Pseudomonas syringae pv. glycinea)Sl菌株中克隆到大小为1038 bp的hrpZ基因，并利用大肠杆菌表达。研究表 明，HarpinPsgsi具有诱导烟草抗病和促生的效果。本专利技术在此基础上，通过研究HarpinP sgsi 中决定HR反应、抗病、促生等生物学效应的功能域，得到抗病、促生效果更好的短肽片段， 更易于体外表达，提高产量和节约成本，利于微生物蛋白农药的产业化。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组蛋白HarpinZA89_m的应用。 本专利技术的目的可通过以下技术方案实现： 氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示的重组蛋白HarpinZA89_124在提高烟草抗烟草花 叶病毒病效果、促进水稻生长、提高水稻抗白叶枯病中的应用。 其中，所述的重组蛋白HarpinZA89_124通过以下步骤制备得到： (1)以DH5 a /pMD18-T-hrpZPsgS1菌株提取的质粒DNA为模板，用上游引物 hrpZ Δ 89_124-P 1、下游引物hrpZ Δ 89_124-P2进行反向PCR扩增，用凝胶回收试剂盒将反向PCR扩 增的片段回收纯化，利用T4 DNA连接酶将回收后的片段进行DNA分子自行环化后，转入大 肠杆菌DH5 α，经酶切及测序验证得到阳性重组菌株DH5 a /pMD18T_hrpZA89_124，其中上游引 物hrpZΔ89_ 124-Pl序列如SEQIDN0·3所示，下游引物hrpZΔ254_298-P2序列如SEQIDN0·4 所示； (2)阳性重组菌株 DH5 a /pMD18-T-hrpZA89_m 提质粒 DNA，经 BamHl 和 EcoRl 双酶 切后连接到表达载体pET30a (+)上，转入大肠杆菌BL21后经质粒PCR及酶切鉴定出阳性菌 株BL21/pET30a(+)-hrpZΛ89- m; ⑶利用LB培养基培养阳性菌株BL21/pET30a⑴-hrpZA89_124,并利用IPTG诱导 重组蛋白表达，菌体经超声波破碎获得粗提蛋白，纯化后得纯化的重组蛋白HarpinZ A89_124。 有益效果： 1.本专利技术获得了一个 HarpinZpsgsi 蛋白的功能片段 HarpinZA89_124,为 HarpinZpsgsi 截去第89-124位氨基酸之后的一个重组蛋白，该蛋白能够在大肠杆菌体内稳定表达，纯化 后每升菌液可得到纯蛋白约40mg。 2.本专利技术所获得的重组蛋白HarpinZA89_124在植物上具有比全长HarpinZ psgsi更好 的生物学效应，同浓度的两个蛋白处理烟草、水稻后，HarpinZA89_ 124对烟草抗花叶病毒病效 果、对水稻抗白叶枯病效果、水稻促生长效果都显著优于全长HarpinZPsgS1。 3.本专利技术所获得的截短片段HarpinZA89_124在植物上有益的生物学效应证实了 Harpin蛋白的不同区域调控不同的功能，对于揭示Harpin蛋白空间结构和功能域有重要 的参考价值，并且相对表达全长来说，短肽片段更易于体外表达，节约成本，利于微生物蛋 白农药的产业化。 【附图说明】 图 I. hrpZA89_124 反向 PCR 扩增 其中 Ml 为 DNA marker DL10000 ;M2 为 DNA marker DS2000 ;1 为 hrpZA89_124 图2.重组质粒pET30a (+) -hrpZ Δ 89_m菌落PCR验证及双酶切验证 A重组质粒pET30a(+)-hrpZA89_m的菌落PCR验证结果。其中M为DNA marker DS2000 ;1 为 hrpZA89_124· B重组质粒pET30a(+)-hrpZA89_124的双酶切验证结果。其中Ml为DNA marker DL10000 ;M2 为 DNA marker DS2000 ;1 为 hrpZA89_124. 图3. IPTG诱导重组蛋白HarpinZA89_124表达及镍柱纯化 A IPTG诱导重组蛋白HarpinZA89_124表达的SDS-PAGE电泳图。其中M为protein marker ;1 为 Harp?ηΖΔ89_124 ;2 为 HarpinZPsgS1 ;3 为 ρΕΤ30· B HarpinZA89_124 纯蛋白 SDS-PAGE 电泳图。其中 M 为 protein marker ;1 为 HarpinZA89_124 ；2 % HarpinZPsgS1. 图4.重组蛋白HarpinZA89_124在烟草上诱导HR反应检测 其中纵排代表重组蛋白HarpinZ λ 89_124及对照HarpinZPsgS1 ,横排代表不同的摩尔浓 度。 图5.重组蛋白HarpinZA89_124诱导烟草抵抗花叶病毒（TMV)侵染 上图为不同蛋白处理后烟草花叶病毒在烟草叶片上引起的病斑数目示意图。下表 为不同蛋白处理后诱导烟草对TMV抗病效果的统计结果，横坐标为不同的处理，纵坐标为 诱导烟草抗TMV效果百分比。 图6.重组蛋白HarpinZA89_124对水稻种子的促生作用 左图为不同蛋白处理后对水稻种子的促生作用示意图，其中1为重组蛋白 HarpinZA89_124, 2 为全长对照 HarpinZPsgS1，3 为对照水。 右图为不同蛋白处理后对水稻根长促生效果的统计结果，横坐标为不同的处理， 纵坐标为水稻根的长度。 图7.重组蛋白HarpinZA89_124诱导水稻抗白叶枯病菌的侵染 左图为不同蛋白处理后对水稻诱导抗白叶枯病示意图，其中1为重组蛋白 HarpinZA89_124,2 为全长对照 HarpinZPsgS1，3 为对照水。 右图为不同蛋白处理后对水稻病斑长度的统计结果，横坐标为不同的处理，纵坐 标为水稻白叶枯病斑的长度。 图8.重组蛋白HarpinZA8本文档来自技高网...
【技术保护点】
氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的重组蛋白HarpinZΔ89‑124在提高烟草抗烟草花叶病毒病效果、促进水稻根部生长、提高水稻抗白叶枯病效果中的应用。
【技术特征摘要】
1. 氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示的重组蛋白他印丨112189_124在提高烟草抗烟草花叶 病毒病效果、促进水稻根部生长、提高水稻抗白叶枯病效果中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的重组蛋白HarpinZA89_124通过以下步 骤制备得到： (1)以DH5 a /pMD18-T-hrpZPsgS1菌株提取的质粒DNA为模板，用上游引物 hrpZ A 89_124-P 1、下游引物hrpZ A 89_124-P2进行反向PCR扩增，用凝胶回收试剂盒将反向PCR扩 增的片段回收纯化，利用T4DNA连接酶将回收后的片段进行DNA分子自行环化后，转入大肠 杆菌DH5 a，经酶切及测序验证得到阳性重组菌株DH...
【专利技术属性】
技术研发人员：高学文，张阳，李响，伍辉军，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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