5-醛基胞嘧啶特异性化学标记方法及相关应用技术

本发明专利技术涉及5-醛基胞嘧啶特异性化学标记方法及在测序、检测、成像及诊疗等方面的相关应用。该方法是利用含有侧链活性基团的活泼亚甲基化合物中的活泼亚甲基与5-醛基胞嘧啶或其1号位取代的衍生物中的醛基发生缩合反应，同时使其侧链活性基团与胞嘧啶4号位氨基发生分子内反应实现关环。利用本发明专利技术的5-醛基胞嘧啶特异性化学标记方法及相关化合物，可实现检测核酸分子中5-醛基胞嘧啶的含量，特异性富集含5-醛基胞嘧啶的核酸样品，分析核酸分子中5-醛基胞嘧啶的序列分布信息和/或单碱基分辨率序列信息等。本发明专利技术为表观遗传学及核酸化学生物学研究领域提供了多个有效的研究方法。

【技术实现步骤摘要】
5-醛基胞嘧啶特异性化学标记方法及相关应用
本专利技术涉及一种表观遗传修饰碱基的化学标记与检测方法、相关化合物的化学合成，以及反应方法和化合物的相关应用，尤其是涉及一种特异性化学标记5-醛基胞嘧啶或其1号位取代的衍生物的方法以及该方法所涉及的化合物在标记、检测、测序、成像和诊疗等方面的应用。
技术介绍
在表观遗传学领域，DNA甲基化与去甲基化研究是最为重要的内容之一。基因调控区的高度甲基化通常导致下游基因的沉默，而去甲基化过程则通常伴随着下游基因的表达激活，从而参与相应的生物学过程。在哺乳动物中，DNA去甲基化过程通过TET(Ten-ElevenTranslocation)家族蛋白的氧化，逐步产生5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmC)、5-醛基胞嘧啶(5-formylcytosine，5fC)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine，5caC)，并通过碱基切除修复通路实现DNA的去甲基化过程(MamtaTahiliani,etal.,Science,2009,324:931-935；SkirmantasKriaucionisandNathanielHeintz,Science,2009,324:929-930；ToniPfaffeneder,etal.,AngewandteChemieInternationalEdition,2011,123:7146–7150；ShinsukeIto,etal.,Science,2011,333:1300-1303；YufeiHe,etal.,Science,2011,333:1303-1307.)。研究此类表观遗传碱基生物学功能的一个重要前提是了解其在基因组中的分布区域和具体序列信息。亚硫酸氢钠测序方法(BisulfiteSequencing)已经是DNA甲基化分析的成熟方法，可以鉴定出单碱基分辨率的5mC序列信息。亚硫酸氢钠处理，使普通的胞嘧啶C转变为尿嘧啶，通过聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)扩增并测序读取为T；而5mC由于5号位供电子效应的甲基存在，使得亚硫酸氢钠处理过程难以发生，因而在PCR扩增和测序过程中仍旧读取为C。5hmC、5fC及5caC作为能稳定存在于基因组中的修饰碱基，也可能存在特有的生物学功能，因此确定这三种胞嘧啶衍生物的基因组分布是探索其功能的重要信息。但5hmC、5fC及5caC的出现使得亚硫酸氢钠测序变得更为复杂。正常亚硫酸氢钠测序过程中，5hmC读取为C，而5fC和5caC均读取为T(MichaelJ.Booth,etal.,Science,2012,336:934-937.)，因而需要发展新的单碱基分辨率测序技术以鉴定这些新修饰碱基的位置。伴随着5hmC检测技术和测序手段的发展(ChunxiaoSong,etal.,Cell,2011,153:678–691；AdamB.Robertson,etal.,NucleicAcidsResearch,2011,39:e55；WilliamA.Pastor,etal.,Nature,2011,473:394-397；ChunxiaoSong,etal.,NatureMethods,2012,9:75-77；MichaelJ.Booth,etal.,Science,2012,336:934-937；MiaoYu,etal.,Cell,2012,149:1368–1380.)，对5hmC的生物学功能已经有了一定的了解；5fC和5caC相应的检测方法虽然也有探索(Eun-AngRaiber,etal.,GenomeBiology,2012,13:R69；LiShen,etal.,Cell,2013,153:692–706；ChunxiaoSong,etal.,Cell,2013,153:678–691；MichaelJ.Booth,etal.,NatureChemistry,2014,6:435-440.)，但要实现高通量、单碱基分辨率同时又以较低成本地检测序列分布状况还并未成熟，因而对后两者的探索还相对滞后。目前针对5-醛基胞嘧啶相关化学反应的研究主要着眼于胞嘧啶环上5号位醛基。基于醛基能够与羟胺化合物的氨基反应生成肟，研究人员设计了针对5fC醛基的反应(ShinsukeIto,etal.,Science,2011,333:1300-1303；Eun-AngRaiber,etal.,GenomeBiology,2012,13:R69；ChunxiaoSong,etal.,Cell,2013,153:678–691.)，并将其应用于检测基因组中5fC的位置；利用醛基与氨基的反应发展了荧光基团标记5fC的方法(JianlinHu,etal.,Chemistry-AEuropeanJournal,2013,19:5836-5840.)；利用NaBH4将醛基还原为羟甲基从而使5fC还原为5hmC，并在亚硫酸氢钠测序过程中5fC位点转变读取为C，也可在特定区域鉴定出5fC碱基的位置(ChunxiaoSong,etal.,Cell,2013,153:678–691；MichaelJ.Booth,etal.,NatureChemistry,2014,6:435-440.)。这些方法作为早期的5fC检测方法，对5fC碱基的研究起到了推进作用。但这些方法存在背景高、成本高、操作过程复杂、单碱基分辨率测序困难等多种缺陷。因此，需要发展一种新的高选择性、高效的5fC标记和检测方法，这对进一步推进表观遗传去甲基化研究具有积极的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，为了克服现有技术中存在的不足，提供了特异性化学标记5-醛基胞嘧啶或其1号位取代的衍生物的方法，该方法包括如下步骤：将含有侧链活性基团的活泼亚甲基化合物与5-醛基胞嘧啶或其1号位取代的衍生物进行反应。其中所述含有侧链活性基团的活泼亚甲基化合物与所述5-醛基胞嘧啶或其1号位取代的衍生物中的胞嘧啶5号位醛基发生脱水缩合反应；同时，所述活泼亚甲基化合物中的侧链活性基团与所述5-醛基胞嘧啶或其1号位取代的衍生物中的胞嘧啶4号位氨基发生分子内反应实现关环。为了清晰地描述本专利技术所涉及的内容，以下展示5-醛基胞嘧啶、5-醛基胞嘧啶的1号位氢原子取代衍生物、5-醛基胞嘧啶脱氧核糖核苷以及5-醛基胞嘧啶核糖核苷的结构式。为方便阐述，如无特殊说明，后文所有“5-醛基胞嘧啶”或“5fC”均指5-醛基胞嘧啶或其1号位的所有相关取代衍生物。其中，5-醛基胞嘧啶1号位取代衍生物可以选自核苷或脱氧核苷、核苷酸或脱氧核苷酸、核糖核酸(RNA，单链或双链)或脱氧核糖核酸(DNA，单链或双链)中以糖苷键与5-醛基胞嘧啶1号位键合的相关小分子化合物或聚合大分子化合物(相应取代基R表示分子内除5-醛基胞嘧啶外的其他结构)，分别构成5-醛基胞嘧啶核糖核苷或5-醛基胞嘧啶脱氧核糖核苷、5-醛基胞嘧啶核糖核苷酸或5-醛基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸、含5-醛基胞嘧啶碱基的RNA或含5-醛基胞嘧啶碱基的DNA。除上述含核糖基或脱氧核糖基的衍生物外，5-醛基胞嘧啶1号位取代衍生物的取代基R也可代表烃基、或带-OH、-NH本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性化学标记5‑醛基胞嘧啶或其1号位取代的衍生物的方法，将含有侧链活性基团的活泼亚甲基化合物R1‑CH2‑R2与5‑醛基胞嘧啶或其1号位取代的衍生物进行反应，其中所述含有侧链活性基团的活泼亚甲基化合物与所述5‑醛基胞嘧啶或其1号位取代的衍生物中的胞嘧啶5号位醛基发生脱水缩合反应，同时，所述活泼亚甲基化合物中的侧链活性基团与所述5‑醛基胞嘧啶或其1号位取代的衍生物中的胞嘧啶4号位氨基发生分子内反应实现关环，如下式所示：其中，R代表氢，烃基，带‑OH、‑NH2、‑CHO和/或‑COOH的烃基，或者是核糖基或脱氧核糖基，5’或3’磷酸修饰的核糖基或脱氧核糖基，核糖核酸或脱氧核糖核酸中以糖苷键与5‑醛基胞嘧啶1号位键合的相关小分子化合物或聚合大分子化合物内除5‑醛基胞嘧啶外的其他结构；R1和R2为吸电子基团，相互独立或成环。

【技术特征摘要】
2013.09.27 CN 201310452515.01.一种特异性化学标记5-醛基胞嘧啶或其1号位取代的衍生物的方法，将含有侧链活性基团的活泼亚甲基化合物R1-CH2-R2与5-醛基胞嘧啶或其1号位取代的衍生物进行反应，其中所述含有侧链活性基团的活泼亚甲基化合物与所述5-醛基胞嘧啶或其1号位取代的衍生物中的胞嘧啶5号位醛基发生脱水缩合反应，同时，所述活泼亚甲基化合物中的侧链活性基团与所述5-醛基胞嘧啶或其1号位取代的衍生物中的胞嘧啶4号位氨基发生分子内反应实现关环，如下式所示：其中，R代表氢，烃基，带-OH、-NH2、-CHO和/或-COOH的烃基，或者是核糖基或脱氧核糖基，5’或3’磷酸修饰的核糖基或脱氧核糖基，核糖核酸或脱氧核糖核酸中以糖苷键与5-醛基胞嘧啶1号位键合的相关小分子化合物或聚合大分子化合物内除5-醛基胞嘧啶外的其他结构；R1和R2为吸电子基团，相互独立或成环，当R1和R2相互独立时，R1选自氰基、硝基、醛基、羰基化合物和羧酸及其衍生物中的一种，R2选自氰基、醛基、羰基化合物和羧酸及其衍生物中的一种，其中R3代表烃基或带-OH、-NH2、-CHO、-COOH、叠氮基团和/或生物素的烃基；当R1和R2成环时，是上述R1和R2基团侧链直接键合成环，或通过C、N或O间接键合成环；所述烃基为C1-C30的直链或带支链的烷基、烯基或炔基。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有侧链活性基团的活泼亚甲基化合物为如式i所示的化合物i，该化合物i与5-醛基胞嘧啶或其1号位取代的衍生物一步反应合成如式I所示的化合物I：其中：R和R1分别如权利要求1所述；R4代表烃基或带-OH、-NH2、-CHO和/或-COOH的烃基；所述烃基为C1-C30的直链或带支链的烷基、烯基或炔基。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述化合物i为乙酰乙酸甲酯、乙酰乙酸乙酯、丙二酸二乙酯或6-叠氮-3-氧代己酸乙酯。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有侧链活性基团的活泼亚甲基化合物为如式ii所示的化合物ii，该化合物ii与5-醛基胞嘧啶或其1号位取代的衍生物在酸性到中性的水溶液中一步反应合成如式II所示的化合物II：其中：R和R1分别如权利要求1所述。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述化合物ii为丙二腈。6.一种特异性化学标记5-醛基胞嘧啶或其1号位取代的衍生物的方法，将如式iii所示的含有侧链活性基团的活泼亚甲基化合物iii与5-醛基胞嘧啶或其1号位取代的衍生物一步反应合成如式III所示的化合物III：其中：R代表氢，烃基，带-OH、-NH2、-CHO和/或-COOH的烃基，或者是核糖基或脱氧核糖基，5’或3’磷酸修饰的核糖基或脱氧核糖基，核糖核酸或脱氧核糖核酸中以糖苷键与5-醛基胞嘧啶1号位键合的相关小分子化合物或聚合大分子化合物内除5-醛基胞嘧啶外的其他结构；R5、R6、R7和R8各自独立地为氢原子、-OH、-NH2、-CHO、-COOH、-CN、-NO2、叠氮基团或烃基，或带-OH、-O-、-NH2、-NH-、-CHO、-COOH、叠氮基团和/或生物素的烃基；所述烃基为C1-C30的直链或带支链的烷基、烯基或炔基。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述化合物iii为1,3茚满二酮或5-(2-叠氮乙基)-1,3-茚满二酮。8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述含有...

【专利技术属性】
技术研发人员：伊成器，夏波，周安坤，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11