一种基于多糖接枝聚天冬氨酸苄酯构建可降解药物载体的方法技术

一种基于多糖接枝聚天冬氨酸苄酯构建可降解药物载体的方法。本发明专利技术公开了非病毒药物载体技术领域的基于多糖(包括环糊精、葡聚糖、壳聚糖、普罗兰等)接枝天冬氨酸构建一系列具有低毒、高效且可降解等优异性能的功能化阳离子药物载体的方法。本方法简单易行，具有分子量可调控性；通过酰胺键的降解促进了药物的释放，通过苄基胺解实现了药物载体的功能化，并且为进行host-gest提供了条件。通过本方法构建的阳离子药物载体在COS7、HepG2、C6、Hella、HEK293、A549等细胞中具有高于金标PEI的转染效率，具有商业化潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种基于多糖接枝聚天冬氨酸苄酯构建可降解药物载体的方法
本专利技术属于非病毒药物载体
，特别涉及了一种基于天然多糖接枝聚天冬氨酸苄酯构建可降解功能化阳离子药物载体的方法，其中包括环糊精、葡聚糖、壳聚糖、普罗兰等。
技术介绍
随着人类生活水平的提高和环境污染的日益加剧，癌症和心脑血管疾病发病率越来越高，严重威胁人类的健康。基因治疗在攻克人类疾病、先天性遗传疾病以及心脑血管疾病方面起着越来越重要的作用，将成为医疗领域攻克重大疾病的主力军。基因治疗包括目的基因的寻找、基因载体的研制以及目的基因在细胞中的特异性表达三个重要方面。基因导入系统是基因治疗的核心技术，缺乏安全而高效的基因载体是目前制约基因治疗实施的主要瓶颈。基因载体是目的基因进入靶细胞的工具，是目的基因在细胞内表达的前提和基础。应用于基因治疗的载体主要分为病毒载体(viralvector)和非病毒载体(non-viralvector)两类。病毒载体主要包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒及单纯疱疹病毒。病毒载体可以克服细胞屏障和免疫防御机制具有较高的转染效率，但是缺乏安全性，可能引起致癌作用与自身免疫反应(unexpectedimmuneresponse)和白细胞的病毒变化，严重时会造成病人多器官衰竭导致死亡。病毒载体还可能会引起插入突变的现象，从而导致宿主细胞的恶行转化，此外病毒载体携带DNA的能力有限，不利于大规模的生产。与病毒性载体相比，非病毒载体安全性高，并且具有低免疫原性。虽然其无法克服细胞内外的各种屏障，转染效率低于病毒性基因载体，但是具有能够携带大量DNA分子、容易大批量生产及费用低廉等显著优点，具有良好的发展潜力，因此基因载体领域的研究者把目光投向人工合成的非病毒载体，致力于合成转染效率高且毒性低的非病毒载体。阳离子聚合物是目前研究最广泛的人工合成非病毒载体。阳离子聚合物能够自发与带负电荷的基因通过电荷相互作用，可形成带正电荷纳米级的复合体(complex)，从而协助基因穿过带负电的细胞膜有效避免质粒被核酸酶降解，保证目的基因顺利表达。随着高分子科学、医学、生物学以及工程学等多门学科的相互交融、相互渗透和迅速发展，高分子基因载体材料进入一个快速发展的时期。目前，文献中报道一系列非病毒阳离子聚合物载体，包括聚-L-赖氨酸(poly(L-Iysine)，PLL)、聚乙二胺树枝状聚合物(poly(amidoamine)，PAMAM)、聚甲基丙烯酸N，N-二甲氛基乙酯(poly(2-dimethylaminoethylmethacrylate),PDMAEMA)、聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)等。其中PEI具有较高的转染效率，是阳离子非病毒载体中公认的“金标”。但是上述阳离子聚合物仍具有相当高的毒性，大大限制了它们的应用。因此，开发低毒而高效阳离子聚合物是研究非病毒基因载体的核心内容。为了降低毒性，目前一种思路是在阳离子聚合物中引入聚乙二醇(PEG)等生物相容性成份，另一种思路是多糖阳离子化，包括壳聚糖(chitosan)、环糊精(cyclodextrin)、葡聚糖(dextran)、普罗兰等。但是上述报道的非病毒载体的安全性和转染效率还远远不能满足实际应用的要求。当前，已经商品化的基因载体只有脂质体lipfect2000，但其成本昂贵，无法成为癌症患者的选择，难以应用于临床治疗。多糖广泛存在于自然界中具有无毒、极好的生物相容、生物可降解、可再生等特性，并且在免疫调节和抗病毒抗癌方面有着出色的表现，非常实用于制备药物释控体系。以天然多糖为基质，接枝阳离子聚合物仍可以保持高的转然效率。在众多的多糖骨架中，现如今研究最多的是壳聚糖、葡聚糖、环糊精、普罗兰、明胶、纤维素、淀粉等一系列多糖。葡聚糖(Dextran)作为一种多糖在免疫调节、抗辐射、调节肠胃、帮助组织结构再生或修复、促进伤口愈合及预防心脑血管和糖尿病等方面均具有突出表现，对肝炎、肿瘤、心血管、糖尿病、降血脂、抗衰老等方面均有独特的生物活性。其特有的靶向性特点，能锁定休眠期、耐药性及亚临床病灶的“残存病毒细胞”，从而“同步”减毒增效，极大限度的保障临床治疗效果。同时，葡聚糖可以快速激活机体自身的免疫监管和识别机制，从而增强它们的战斗力，使自身免疫系统达到最佳平衡状态，保持肌体的健康。普罗兰多糖(Pullulan)是一种由出芽短梗霉发酵所产生的类似葡聚糖、黄原胶的胞外水溶性粘质多糖，它除了具备其他多糖所具有的优点之外，其本身带有一定的肿瘤靶性，因而近几年在广泛应用于肿瘤治疗方面的研究。环糊精(Cyclodextrin，简称CD)是直链淀粉在由芽孢杆菌产生的环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称，通常含有6～12个D-吡喃葡萄糖单元。环糊精分子具有略呈锥形的中空圆筒立体环状结构，在其空洞结构中，外侧上端(较大开口端)由C2和C3的仲羟基构成，下端(较小开口端)由C6的伯羟基构成，具有亲水性，而空腔内由于受到C-H键的屏蔽作用形成了疏水区。乙二胺(Ethylenediamine，ED)无色或微黄色黏稠液体，有类似氨的气味，呈强碱性。阳离子药物载体携带DNA的能力随分子量的增大而增大，但同时毒性也在增大从而限制了转染效率。因此，发展可降解阳离子载体具有十分重大的意义。除了可生物降解的基于PLL、PAA和甲基丙烯酸酯的大分子，各种其它可降解的化合物也已经合成并用于研究基因转染。其中包括聚(氨基酸)，聚(氨基酯)和含磷基的聚合物。聚氨基酸被广泛的应用于生物医用领域，这得益于它们的低毒性，良好的生物相容性和生物降解性。特别是聚天冬氨酸，被广泛的用于制备纳米颗粒、胶束、纳米胶囊和生物膜，用来作为药物载体材料。尽管天然多糖及聚天冬氨酸已被广泛应用于药物载体领域，有了很多研究成果，但基于天然多糖接枝聚天冬氨酸基构建可降解功能化阳离子载体目前还没有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基于天然多糖接枝聚天冬氨酸构建可降解功能化阳离子药物载体的方法。该方法利用具有无毒、极好的生物相容、生物可降解、可再生等优良性能的包括环糊精、葡聚糖、壳聚糖以及普罗兰在内天然多糖接枝降解性能优良的聚天冬氨酸作为基体，既可以通过苄酯进行胺解、组装又可以通过环糊精空腔与其它分子进行组装，从而实现天然多糖接枝聚天冬氨酸基可降解药物载体的功能化，具有商业化潜力。本专利技术的反应体系中，引发剂的合成从多糖本体开始，激活多糖本体上的官能团羟基，将乙二胺与激活的官能团反应，使得乙二胺接入到多糖本体上作为大分子引发剂的引发点，得到多糖大分子引发剂。然后通过开环聚合(ring-opening)引发天冬氨酸苄酯单体聚合得到天然多糖接枝聚天冬氨酸基体，对所得的基体或通过与各种二胺的反应形成阳离子药物载体，或与其它阳离子小分子进行组装形成功能化阳离子药物载体。功能性阳离子的引入：一是利用胺解同样的原理，直接采用或通过化学反应使带有功能性基团的物质带上胺基，转化为胺解反应。另一种是利用苄基或者引进环糊精空腔与功能性阳离子进行自组装。本专利技术所述的基于多糖接枝聚天冬氨酸苄酯构建可降解药物载体的方法，其具体反应条件为：1)聚合反应：该聚合反应体系由多糖大分子引发剂、有机溶剂、单体组成；多糖大分子引发剂上的胺基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于多糖接枝聚天冬氨酸苄酯构建可降解药物载体的方法，其特征在于，其具体反应条件为： 1)聚合反应：该聚合反应体系由多糖大分子引发剂、有机溶剂、单体组成；多糖大分子引发剂上的胺基、有机溶剂、单体之间的摩尔比为(1:0.01:10)‑(1:0.07：100)反应温度为40‑50℃；无水无氧环境下反应3‑5天；反应完成后用乙醚或丙酮沉淀直到形貌变为固体，最后放入真空干燥箱抽干除去乙醚或丙酮得到多糖接枝聚天冬氨酸β‑苄酯基聚合物； 2)将步骤1)中初步得到的多糖接枝聚天冬氨酸β‑苄酯基聚合物的苄基与含两个及以上氨基的胺类化合物按摩尔比为1:8‑1:14溶于二甲基亚砜或吡咯烷酮中进行胺解反应，多糖接枝聚天冬氨酸β‑苄酯基聚合物与二甲基亚砜质量比为(1:7)‑(1:11)，多糖接枝聚天冬氨酸β‑苄酯基聚合物与吡咯烷酮质量比为(1:10)‑(1:20)；反应温度为室温，无氧无水条件下反应10‑12小时；同样反应完成后用乙醚或丙酮沉淀直到形貌变为固体，放入真空干燥箱抽干除去乙醚或丙酮，然后将产物溶解在水中，加水量与产物的比例为100‑300ml/g，产物溶解后放入截留分子量为7000MW的透析袋中，在去离子水中透析；最后将透析袋中的产物冷冻干燥直至除去所有水分即得基于多糖接枝聚天冬氨酸苄酯构建的可降解药物载体。...

【技术特征摘要】
1.一种基于多糖接枝聚天冬氨酸苄酯构建可降解药物载体的方法，其特征在于，其具体反应条件为：1)聚合反应：该聚合反应体系由多糖大分子引发剂、有机溶剂、单体组成；多糖大分子引发剂上的胺基、有机溶剂、单体之间的摩尔比为(1:0.01:10)-(1:0.07：100)，反应温度为40-50℃；无水无氧环境下反应3-5天；反应完成后用乙醚或丙酮沉淀直到形貌变为固体，最后放入真空干燥箱抽干除去乙醚或丙酮得到多糖接枝聚天冬氨酸β-苄酯基聚合物；2)将步骤1)中初步得到的多糖接枝聚天冬氨酸β-苄酯基聚合物的苄基与乙二胺或二亚乙基三胺按摩尔比为1:8-1:14溶于二甲基亚砜或吡咯烷酮中进行胺解反应，多糖接枝聚天冬氨酸β-苄酯基聚合物与二甲基亚砜质量比为(1:7)-(1:11)，多糖接枝聚天冬氨酸β-苄酯基聚合物与吡咯烷酮质量比为(1:10)-(1:20)；反应温度为室温，无氧无水条件下反应10-12小时；同样反应完成后用乙醚或丙酮沉淀直到形貌变为固体，放入真空干燥箱抽干除去乙醚或丙酮，然后将产物溶解在水中，加水量与产物的比例为100-300mL/g，产物溶解后放入截留分子量为7000Mw的透析袋中，在去离子水中透析；最后将透析袋中的...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐福建，宋海情，窦学博，苑慧敏，
申请(专利权)人：北京化工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11