一种富集纯化血小板的方法技术

本发明专利技术公开了一种富集纯化血小板的方法，全血中加入抗凝剂，1000rpm离心10分钟，吸取红细胞层以上部分，剩余红细胞层中加入生理盐水，1000rpm离心10分钟，取红细胞层以上部分，两者混合得到富集物C；富集物C中加入红细胞裂解液，混匀后静置半小时后以1500rpm离心20分钟，收集上清液A与中间白色絮状层A，上清液A以1500rpm离心10分钟，收集其底部白色层B，与中间白色絮状层A混合，再加入生理盐水，1500rpm离心10分钟，收集中间白色层C，收集物即为浓缩富集的血小板。本发明专利技术在离心富集的基础上加入了去血浆和破红细胞的纯化方法，能完全去除红细胞，有效提高血小板富集纯度、减少白细胞和红细胞污染。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了，全血中加入抗凝剂，1000rpm离心10分钟，吸取红细胞层以上部分，剩余红细胞层中加入生理盐水，1000rpm离心10分钟，取红细胞层以上部分，两者混合得到富集物C；富集物C中加入红细胞裂解液，混匀后静置半小时后以1500rpm离心20分钟，收集上清液A与中间白色絮状层A，上清液A以1500rpm离心10分钟，收集其底部白色层B，与中间白色絮状层A混合，再加入生理盐水，1500rpm离心10分钟，收集中间白色层C，收集物即为浓缩富集的血小板。本专利技术在离心富集的基础上加入了去血浆和破红细胞的纯化方法，能完全去除红细胞，有效提高血小板富集纯度、减少白细胞和红细胞污染。【专利说明】
： 本专利技术属于生物医学
，涉及一种适用于包括人与实验动物在内不同种属 高纯度血小板的离心制备方法。
技术介绍
： 血小板（platelet)是哺乳动物血液中的无核细胞，小于红细胞和白细胞，除 了可以在止血的时候提供凝聚作用外，还能通过胞内a颗粒的脱颗粒作用释放大量 细胞生长因子，包括血小板源性生长因子（PDGF)、转化生长因子(TGF-P)、类胰岛 素生长因子-l(IGF-l)、成纤维细胞生长因子（FGF)、血管内皮生长因子（VEGF)等， 可诱导骨细胞的分裂增殖及胶原合成，促进骨组织的修复与重建（Marx RE, Implant Dent，2001，10(4) :225-228)。其中，TOGF可促进成骨细胞的趋化、增殖，增加胶原蛋白的 合成能力；TGF-P具有刺激成骨前体细胞及成骨细胞的趋化和增殖、抑制破骨细胞形成和 骨吸收的作用；IGF-I能增加成骨细胞活力、促进软骨与骨基质生成；VEGF可促进新生血管 形成，有利于病灶区营养物质的供给，还能直接作用于成骨细胞和软骨细胞，增强其迁移、 增值和细胞活力（Bouletreau PJ, et al.，Plast Reconstr Surg, 2002, 110 (1):139-148; Maeda S, et al. , EMOB J,2004,23 (3):552-563 ；Trippel SB1Clin Orthop Relat Res. 1998. (355Suppl) :301-313 ；Ferrara N, et al. ,Nat Med. 2003. 9(6) :669-676) 〇 血小 板可从患者自身全血中提取，经富集处理后发挥治疗作用，具有来源丰富，取材方便，分离 简单等特点，广泛应用于骨科、口腔科、运动医学等领域。现有的血小板手工制备方法是富 血小板血浆（PRP)法，得到PRP用于实验研究和临床治疗。 PRP是全血经过离心分离得到的血小板浓缩物，其制备原理是利用血液中各种成 分沉降速度不同，通过离心将血液分层。全血经低速离心可分为三层，上层是贫血小板血浆 层（PPP)、中间为富血小板血浆层（PRP)、下层为红细胞层，取中间层可得到高度浓缩的含 血小板血浆。一般认为，人体全血中血小板浓度为1?3X105/ml，PRP中的血小板浓度应 达到全血血小板浓度的4倍以上，含有的生长因子浓度也应在3倍以上（Marx et al.，Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod, 1998, 85(6):638 ；Landesberg et al. , J Oral Maxillofac Surg, 2000, 58(3):297 ；Dugrillon et al.,Int J Oral Maxillofac Surg, 2002, 31 (6) :615.)。现有的PRP制备方法有一次离心法和二次离心法。公认的一次 离心法是Anitua法，是将10?20ml全血加入5ml含抗凝剂的离心管中，以160g离心6 分钟，上层是PPP，下层是红细胞，两层交界处可见一很薄的浅黄色层，即PRP层；弃去上层 (PPP) lml，吸取剩余上层血楽至下层（红细胞层）1?2mm，得到PRP (Anitua, Int J Oral Maxillofac Implants, 1999, 14 (4) : 529-535.)。用 Anitua -次离心法每次能从 5ml 全血 中获取约I. 2mlPRP。公认的二次离心法有Landesberg法、Petrungaro法和Aghaloo法， 三者的区别是离心力和离心时间的不同。如Landesberg法第一次200g离心10分钟，吸 管吸取全部上清液（PPP+PRP)至交界面下3mm，移至另一离心管，平衡后第二次200g离心 10分钟，吸取约3/4上清液（PPP)废弃，剩余摇匀即为PRP ;Petrungaro法第一次1500g 离心6分钟，第二次IOOOg离心6分钟；Aghaloo法第一次215g离心10分钟，第二次 863g 离心 10 分钟（Landesberg et al.，J Oral Maxillofac Surg, 2000, 58 (3) :297-300; PetrungarojCompend Contin Educ Dent, 2001, 22(9):729-732 ；Aghaloo et al. , J Oral Maxillofac Surg, 2002, 60(10) : 1176-1181.)。上述三种二次离心法的血小板数与血小板 回收率比较可知，Aghaloo法获得的血小板数最多，回收率最高（张长青和袁霆，上海科学 技术出版社，2011，p32-33.)。 目前虽然能制备出浓度达标的PRP，但其技术尚未完全成熟。无论一次离心法还是 二次离心法都存在诸多缺点，极大地限制其在实验室和临床的应用：①缺少质量控制体系 和公认的统一标准，无法保证每次制备PRP的重复性和生物稳定性；②血小板和生长因子 获得率和纯度相对较低，仍有大量白细胞和红细胞污染，具有潜在风险；③无法避免血浆残 留引起的不良反应（Brittinghan and Chaplin, JAMA, 1957, 165(7) :819-825.)。因此，现有 的PRP制备方法仍有待改进。 赖真阳等（CN 102367435B，中国专利申请号201110344464. 0,专利技术名称：人富血 小板血浆的制备及在人间充质干细胞分离培养中的应用）公开了一种人富血小板血浆的 制备方法，所得产物用于人间充质干细胞的分离、培养具有较理想的效果。该方法以二次 离心法收集全血中血小板并进行<o°c和不低于常温条件的反复冻一融处理，去除沉淀得 到富血小板血浆。反复冻融能使血小板破裂，释放大量细胞生长因子。因此该专利技术获得的 主要成分实际为富含生长因子的血小板裂解液，最后去除沉淀步骤已去除所有细胞残留， 即该产物不存在血小板。郑秋坚等（CN 103505910A，中国专利申请号201310480780. X，发 明名称：一种一次离心法制备富血小板血浆的方法）公开了一种一次离心法制备富血小板 血浆的方法，类似于前文提到的Anitua法。林子洪等（CN 103505911A，中国专利申请号 201310480851. 6,专利技术名称：一种以手工二次离心法制备富本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种富集纯化血小板的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：(1)全血中加入抗凝剂，以1000rpm离心10分钟，离心结束后，吸取红细胞层以上部分，得到富集物A；剩余红细胞层中加入生理盐水，再以1000rpm离心10分钟，取红细胞层以上部分，得到富集物B，富集物B与富集物A混合，得到富集物C；(2)向富集物C中加入红细胞裂解液，混匀后静置半小时后以1500rpm离心20分钟，分别收集上清液A与中间白色絮状层A，上清液A以1500rpm离心10分钟，收集其底部白色层B，与中间白色絮状层A混合，再加入生理盐水，以1500rpm离心10分钟，弃上清液B，收集中间白色层C，收集时避免底部红色残留，收集物即为浓缩富集的血小板。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：童培建，单乐天，金红婷，肖鲁伟，金王东，郎晓丽，
申请(专利权)人：浙江中医药大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33