与gp41蛋白结合的多肽、多肽芯片、其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一组与gp41蛋白结合的多肽、多肽芯片、其制备方法和应用。该组多肽与gp41蛋白有很强的特异性结合能力，能够实现了对gp41蛋白在低浓度时的检测。该多肽芯片利用表面等离激元共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)原理制备而成，当所有该组多肽分子均与目标发生结合时，判断gp41蛋白存在，减少了实验过程中假阳性结果。此外，本发明专利技术还提供包含该组多肽的药物组合物。本发明专利技术在HIV感染引起的疾病的诊断方面有重要应用价值。

【技术实现步骤摘要】
与gp41蛋白结合的多肽、多肽芯片、其制备方法和应用
本专利技术涉及生物医学
，具体涉及与gp41蛋白结合的多肽、多肽芯片、其制备方法和应用。
技术介绍
获得性免疫缺陷综合征（AcquiredImmuneDeficiencySyndrome，AIDS）是因为感染人类免疫缺陷病毒（HumanImmunodeficiencyVirus，HIV）而导致免疫缺陷，并发一系列机会性感染及肿瘤等的综合征。它是一类流行较广，致死率高的疾病。在当前仍然缺少普适的治疗方法的情况下，尽早地发现人类免疫缺陷病毒，及时地诊断病症，阻断传播途径，对于减少其危害有着重要的意义。HIV可以感染多种细胞，包括在表面表达CD4分子的T4淋巴细胞、单核巨噬细胞和树突状细胞等。CD4分子是HIV入侵细胞的受体，而糖蛋白gp41介导了HIV病毒与CD4细胞的融合，从而使HIV进入细胞内。以gp41分子为药物设计靶点，可能是实现对HIV有效检测与治疗获得性免疫缺陷综合征的一种途径。基于gp41的分子结构，目前已经开发出了多种相关的抑制剂与单克隆抗体，并有些基于这些抗体的芯片产生。但是目前用于检测gp41蛋白的单克隆抗体芯片存在以下问题：（1）使用的单克隆抗体与gp41蛋白的相互作用力较弱，造成对gp41蛋白的检出限较低，传统的gp41单克隆抗体制备的芯片检出限高于200nM；（2）由于仅基于一种或少数几种gp41单克隆抗体的阳性结果进行判断，导致实验过程中较多假阳性结果的产生；（3）gp41单克隆抗体芯片很容易因抗体的构象变化导致抗体失活，芯片失效；（4）gp41单克隆抗体的成本较高，导致gp41单克隆抗体芯片的成本难以降低，大规模应用受到限制。因此，针对gp41蛋白，开发出检出限低、特异性高、性能稳定及成本较低的芯片，对于HIV病毒的检测具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术人经过大量实验和创造性劳动，得到了一组多肽，并发现这组多肽与gp41蛋白有很强的特异性结合能力，能够制备成多肽芯片或药物组合物等，应用于诊断或辅助性诊断HIV感染引起的疾病。本专利技术提供以下技术方案：在第一方面，本专利技术提供一种与gp41蛋白结合的多肽，所述多肽具有选自SEQIDNO：1～7所示的氨基酸序列：（1）GGLDAIRAQQDL（SEQIDNO：1）；（2）GGSNDSLRQIWNDTTWMRWRDRI（SEQIDNO：2）；（3）GGIDSLIRRSQN（SEQIDNO：3）；（4）GGWRRLDSLCLFSYDDLDRLL（SEQIDNO：4）；（5）GGTDIVRLLGDDGWRALDY（SEQIDNO：5）；（6）GGSQRLDNS（SEQIDNO：6）；和（7）GGNNLLDAIRAQQDL（SEQIDNO：7）。所述多肽可以通过人工化学合成制得，其与gp41蛋白有很强的特异性结合能力。在第二方面，本专利技术提供一种多肽芯片，其包括固定于固相载体上的、能够与gp41蛋白结合的多肽，所述多肽具有选自SEQIDNO：1～7所示的氨基酸序列。所述多肽芯片上的多肽与gp41蛋白有很强的特异性结合能力，可以用于gp41蛋白的检测，并据此判断HIV病毒的感染情况。在本专利技术一个实施方案中，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1～7所示，即包含上述七条多肽。在第三方面，本专利技术提供一种如第二方面所述的多肽芯片的制备方法，利用表面等离激元共振(SurfacePlasmonResonance，SPR)原理，所述方法包括：（1）对固相载体进行预处理，形成备用固相载体；（2）将稀释好的所述多肽点样到所述备用固相载体上。在本专利技术一个实施方案中，所述步骤（1）具体包括：（1a）在SPR芯片表面通过共价键，修饰上一层含羧基的硫醇分子自组装层；（1b）以乙醇清洗SPR芯片表面两次；（1c）使用碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺活化SPR芯片表面，使醇分子自组装层上的羧基形成不稳定的琥珀酰亚胺酯；（1d）以乙醇清洗SPR芯片表面两次。在本专利技术一个实施方案中，所述步骤（2）还包括对所述多肽进行预处理，及点样后的处理；具体地，所述步骤（2）包括：（2a）将链霉亲和素与N端修饰生物素的多肽分子按摩尔比为1：1的比例混合，且混合后链霉亲和素的质量浓度为1mg/mL，形成链霉亲和素-多肽混合液；（2b）将0.2μL链霉亲和素-多肽混合液滴在SPR芯片表面，以gp41的单克隆抗体作为阳性对照，取0.2μL滴在SPR芯片表面；（2c）以乙醇胺封闭表面未参与反应的琥珀酰亚胺酯与双硫醇上的羧基；（2d）以乙醇清洗SPR芯片表面两次；（2e）将SPR芯片用微流控膜封装，装入SPR仪器中；（2f）以0.5%(体积比)磷酸与1×PBS（磷酸盐缓冲液）反复交替清洗SPR芯片表面，直到SPR芯片表面的固定相SPR信号保持平稳为止；（2g）以1×PBS作为解离相，以0.5%(体积比)磷酸作为重生液，测试SPR芯片对gp41的1×PBS溶液的响应。本专利技术还提供一种多参数检测样品中gp41蛋白的方法，包括如下步骤：（1）同时记录所述多肽芯片上所设计的多肽在通过样品时的SPR信号；（2）当七条多肽（SEQIDNO：1～7）都能产生吸附峰信号时，证明样品中存在gp41。本专利技术提供的与gp41蛋白有强相互作用的多肽序列，其一级结构序列中同源性较低，可能对应于gp41蛋白表面不同的结合位点。只有当七条多肽分子均与目标发生结合时，才判断gp41蛋白的存在，这在一定程度上减少了实验过程中假阳性结果的产生。在第四方面，本专利技术提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如第一方面所述的多肽，还可以包括任选的可药用载体。在第五方面，本专利技术提供一种如第一方面所述的多肽、如第二方面所述的多肽芯片或如第四方面所述的药物组合物在制备用于诊断或辅助性诊断HIV感染引起的疾病的药物中的应用。本专利技术的有益效果为：（1）本专利技术提供的多肽与gp41蛋白的亲和力强，实现了对gp41蛋白在低浓度时的检测，基于所述多肽制备的多肽芯片可以检出50nM的gp41蛋白，而传统的gp41单克隆抗体制备的芯片检出限高于200nM，本专利技术多肽芯片可辅助临床准确诊断HIV相关疾病；（2）本专利技术提供的多肽芯片只有当七条多肽分子均与目标发生结合时，才判断gp41蛋白的存在，这在一定程度上减少了实验过程中假阳性结果的产生；（3）本专利技术提供的多肽相比gp41单克隆抗体的稳定性高，不会发生由于构象变化导致的失活，芯片的效期更长；（4）本专利技术提供的多肽相比gp41单克隆抗体成本更低，可以大规模应用；（5）本专利技术提供的多肽对于gp41相关疾病的多肽类先导化合物的发现和预测，提供药物母核的设计模型，并为已有的药物结构改造提供参考依据与标准；（6）本专利技术提供的靶向gp41分子的多肽序列可以被应用于通过酶联免疫吸附方法、表面等离激元共振技术、石英振动微天平技术分析、飞行时间质谱及等温滴定微量热检测gp41；此外，本专利技术提供的靶向gp41分子的多肽可以经过量子点修饰、荧光素基团修饰及辣根过氧化物酶修饰等用于酶联免疫吸附、荧光发射光谱及紫外吸收光谱等分析方法中检测gp41分子。附图说明图1为基于本专利技术开发的多肽41-1～41-7、24-5及gp41单克隆抗体与gp41的结合解离过程的SPR曲线。其中：图1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与gp41蛋白结合的多肽，其特征在于，所述多肽具有选自SEQ ID NO：1～7所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种与gp41蛋白结合的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。2.一种多肽芯片，其特征在于，所述多肽芯片包括固定于固相载体上的、能够与gp41蛋白结合的多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。3.一种如权利要求2所述的多肽芯片的制备方法，其特征在于，所述方法包括：(1)对固相载体进行预处理，形成备用固相载体；(2)将稀释好的多肽点样到所述备用固相载体上。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：(1a)在SPR芯片表面通过共价键，修饰上一层含羧基的硫醇分子自组装层；(1b)以乙醇清洗SPR芯片表面两次；(1c)使用碳二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺活化SPR芯片表面，使醇分子自组装层上的羧基形成不稳定的琥珀酰亚胺酯；(1d)以乙醇清洗SPR芯片表面两次。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)还包括对所述多肽进行预处理，及点样后的处理；具体地，所述步骤(2)包括：(2a)将链霉亲和...

【专利技术属性】
技术研发人员：王琛，王晨轩，王艳梅，朱劲松，杨延莲，
申请(专利权)人：国家纳米科学中心，
类型：发明
国别省市：北京;11