不结球白菜自交不亲和鉴定的SSR分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种不结球白菜自交不亲和鉴定的SSR分子标记及其应用，其标记引物为Na12E02、KBRH138G23或BrSS15中的至少一种。本方法的SSR分子标记，可以应用于不结球白菜自交不亲和性的快速鉴定和检测，提高育种效率，加速育种进程。

【技术实现步骤摘要】
不结球白菜自交不亲和鉴定的SSR分子标记及其应用
本专利技术属于作物遗传育种与生物
，具体涉及不结球白菜自交不亲和基因连锁的SSR分子标记及用应用。
技术介绍
不结球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensisMakino)俗称青菜，小白菜，属于十字花科芸薹属芸薹种，是我国主要的叶菜类蔬菜。具有适应性强，生长期短、品质柔嫩、风味独特、营养丰富等特点，是我国南方人民终年喜食的大众化蔬菜，在蔬菜周年供应中占有重要地位。每年播种面积约800万亩，占长江中、下游地区蔬菜复种面积的30～40％。近年来不仅北方大量引种栽培，在东南亚、日本、美国及欧洲等国家和地区也广泛引种，逐渐成为世界性的蔬菜。作为异花授粉作物，不结球白菜具有典型的自交不亲和性，杂种优势显著。为了提高不结球白菜的产量和品质，生产上多采用杂种一代进行制种。20世纪70年代中期，北京、上海、山东等地区开始应用自交不亲和系配制杂种进行白菜生产，取得了显著增产效果。利用自交不亲和系进行不结球白菜生产，可以获得较高的F1代杂交种产率，不会产生不良的胞质缺陷。因此自交不亲和育种是目前不结球白菜种质资源繁育的重要途径之一。但是对于自交不亲和性的鉴定存在较大难度。传统的检测方法包括荧光显微镜检法、亲和指数法等，需要在花期或结种后进行检测，周期长，操作繁琐，耗费大量的人力和物力，效率较低。分子生物技术的飞速发展，特别是分子标记技术的建立和成熟，为作物的品种鉴定和遗传多样性分析提供了简单快捷的方法。分子标记辅助育种可以大大加快不结球白菜自交不亲和系的育种进程，提高育种效率。常用的分子标记包括SSR、AFLP、RAPD和AFLP等。其中SSR标记由于具有数量丰富、多态性高、重复性好等诸多优点，在生产科研领域被广泛应用。但是目前国内外关于不结球白菜自交不亲和分子标记的研究较少。史公军(不结球白菜自交不亲和基因的分子标记，硕士论文，南京农业大学，2001)利用RAPD标记获得了一个与不结球白菜自交不亲和性相关的分子标记，其遗传距离为7.54cM。由于RAPD标记为显性标记，不能区分杂合基因型和纯和基因型，并且操作繁琐，重复性和稳定性较差，无法用于实际生产中不结球白菜自交不亲和性的检测。目前关于不结球白菜自交不亲和基因连锁SSR分子标记的获得方法与应用未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对不结球白菜育种中亲和指数法的缺陷，如检测周期长、工作量大、容易受环境条件限制等，提供一种能够对苗期不结球白菜进行自交不亲和性检测的SSR分子标记，从而对不结球白菜植株的自交不亲和性进行快速鉴定，加快不结球白菜分子标记辅助育种进程。本专利技术的目的可以通过以下措施达到：一种不结球白菜自交不亲和鉴定的SSR分子标记或者引物组合物，其特征在于其标记引物为Na12E02、KBRH138G23或BrSS15中的至少一种，其中标记引物Na12E02为：正向引物：5’-TTGAAGTAGTTGGAGTAATTGGAGG-3’，反向引物：5’-CAGCAGCCACAACCTTACG-3’；标记引物KBRH138G23为：正向引物：5’-TTTGACATCGTGCAATGCTA-3’，反向引物：5’-TTGGGCTGGTCCTGAAGATA-3’；标记引物BrSS15为：正向引物：5’-CCATTCGCGAGGTTAGATTC-3’，反向引物：5’-ACACAGCCACATCAAACCAA-3’。本专利技术中优选的标记引物为BrSS15。本专利技术的SSR分子标记的引物组合物可以应用在不结球白菜自交不亲和基因鉴定方面。该应用可包括如下步骤：通过PCR扩增育种分离世代材料的DNA，如果能够扩增出150bp片段、380bp片段或240bp片段中的至少一种，则标志着不结球白菜自交不亲和基因的存在。特别是对于标记引物Na12E02，在扩增时如果能够扩出150bp片段，则标志着不结球白菜自交不亲和基因的存在；对于标记引物KBRH138G23，对不结球白菜DNA进行扩增时，如果能够扩出380bp片段，则标志着不结球白菜自交不亲和基因的存在；对于标记引物BrSS15，对不结球白菜DNA进行扩增，如果能够扩出240bp片段，则标志着不结球白菜自交不亲和基因的存在。本专利技术中所述的育种分离世代材料为近等基因系获得的高度分离的F2后代群体或者高度分离的BC1后代群体。本专利技术的不结球白菜自交不亲和性SSR分子标记获得方法按以下步骤进行：从育种分离世代材料中提取DNA。根据已发表的文献资料，初步筛选出2个与不结球白菜自交不亲和基因有关的SSR分子标记Na12E02和KBRH138G23。为获得与自交不亲和基因遗传距离较近的分子标记，利用大白菜基因组数据库(http://brassicadb.org)，在Na12E02附近3cM范围内开发设计SSR引物。根据PCR扩增结果筛选出与不结球白菜自交不亲和基因连锁的SSR分子标记BrSS15。本专利技术的不结球白菜自交不亲和基因连锁的SSR分子标记获得方法具体包括如下步骤：(1)从育种分离世代材料中提取DNA：选择不结球白菜自交不亲和分离世代材料P1、P2、F1和F2的种子进行播种；待幼苗长至3～4片真叶时，每植株取1片幼叶，用改良的CTAB法提取DNA；(2)不结球白菜自交不亲和SSR分子标记的筛选：根据已发表的文献资料，从332对SSR引物中初步选择用于不结球白菜自交不亲和基因筛选的分子标记进行PCR扩增。根据PCR扩增的纯合和杂合带型以及亲和指数统计结果，从中筛选出2个与不结球白菜自交不亲和基因有关的SSR分子标记，引物序列如下：Na12E02：正向引物：5’-TTGAAGTAGTTGGAGTAATTGGAGG-3’，反向引物：5’-CAGCAGCCACAACCTTACG-3’；KBRH138G23：正向引物：5’-TTTGACATCGTGCAATGCTA-3’，反向引物：5’-TTGGGCTGGTCCTGAAGATA-3’。(3)不结球白菜自交不亲和基因连锁SSR分子标记的开发：在Perl语言环境下运行MISA软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)，利用大白菜基因组数据库(http://brassicadb.org)，在Na12E02附近3cM范围内开发设计SSR引物。利用Primer3.0引物设计软件对检索到的SSR序列进行批量引物设计。根据PCR扩增和电泳结果，从中筛选出与不结球白菜自交不亲和基因连锁的SSR分子标记BrSS15，引物序列为：正向引物：5’-CCATTCGCGAGGTTAGATTC-3’，反向引物：5’-ACACAGCCACATCAAACCAA-3’。(4)SSR分子标记的PCR扩增：以提取的DNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增反应包括以下步骤：扩增体系的总体积为10微升，40ng·μL-1DNA模板0.5μL，10×PCRbuffer1μL，Mg2+0.8μL，2.5mmol·L-1dNTPs0.8μL，100ng·μL-1的上，反向引物各0.5μL，2.5U·μL-1的Taq酶0.1μl，ddH2O5.8μl；PCR反应程序为：95℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种不结球白菜自交不亲和鉴定的SSR分子标记，其特征在于其标记引物为Na12E02、KBRH138G23或BrSS15中的至少一种，其中标记引物Na12E02为：正向引物：5’‑TTGAAGTAGTTGGAGTAATTGGAGG‑3’，反向引物：5’‑CAGCAGCCACAACCTTACG‑3’；标记引物KBRH138G23为：正向引物：5’‑TTTGACATCGTGCAATGCTA‑3’，反向引物：5’‑TTGGGCTGGTCCTGAAGATA‑3’；标记引物BrSS15为：正向引物：5’‑CCATTCGCGAGGTTAGATTC‑3’，反向引物：5’‑ACACAGCCACATCAAACCAA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种不结球白菜自交不亲和鉴定的SSR分子标记的引物组合物，其特征在于其标记引物为BrSS15：正向引物：5’-CCATTCGCGAGGTTAGATTC-3’，反向引物：5’-ACACAGCCACATCAAACCAA-3’。2.权利要求1所述的不结球白菜自交不亲和鉴定的SSR分子标记的引物组合物在不结球白菜自交不亲和基因鉴定方面的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于包括如下步骤：通过PCR扩增从育种分离世代材料中提取的DNA，如果能够扩增出240bp片段，则标志着不结球白菜自交不亲和基因的存在。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于PCR反应体系为：每10微升体系中，40ng·µL-1DNA模板0.5µL，10×PCRbuffer1µL，Mg2＋0.8µL，2.5mmol·L-1dNTPs0.8µL，100ng·µL-1的正/反向引物各0.5µL，2.5U·µL-1的Taq酶0.1µl，ddH2O5.8µl；PCR扩增反应程序为：95℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min；采用改良的CTAB法从育种分离世代材料中提取DNA，其步骤为：配制CTAB缓冲液，每100mL中含有：CTAB2g，pH8.0的Tris...

【专利技术属性】
技术研发人员：李英，葛婷婷，侯喜林，王立，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32