本发明专利技术公开了一种诊断人类病原真菌感染的免疫荧光诊断试剂及其制备方法。以临床分离的病原真菌制备多克隆抗体或单克隆抗体，然后将抗体与荧光纳米量子点材料经酰胺脱水缩合，连接为荧光纳米量子点-抗体复合物，可直接用于对载体材料上已包被未知抗原（待测患者标本）的样品进行检测，也可预先将抗体包被在载体材料上，进而检测未知抗原。本发明专利技术具有对临床病原真菌感染检测特异性强，重复性好，操作便捷，检测准确快速等优点，能有效指导临床用药，减少抗生素滥用，降低患者的诊断检测及治疗费用,从而产生良好的经济效益和社会效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及可检测人体真菌感染的快速检测免疫荧光诊断试剂。具体涉及人真菌感染免疫荧光诊断试剂的制备及应用。
技术介绍
病原真菌是一类极为重要的临床致病微生物，主要包括念珠菌属、曲霉属、青霉属、隐球酵母属、毛癣菌属、孢子丝菌属等。在健康人群中，这类真菌通常与机体处于共生状态。然而，在机体免疫力降低，或者局部微生态失调的情况下，该类真菌极易从共生态转变为致病态。尤其是念珠菌属、曲霉属、隐球酵母属等条件致病真菌不仅能引起浅层感染，还能导致播散性感染，从而危及生命。近年来，由于重症特护人群、免疫缺陷人群、放化疗人群的不断扩大及抗生素的滥用，条件致病真菌已成为医院获得性感染的主要病原菌之一，由其引发的播散性真菌病的感染率及死亡率呈不断上升态势，受到广泛关注。所以一旦病人发生了真菌感染，就有必要尽可能快速和准确地确定该致病菌的种类、性质和药敏检测结果，以便临床医师选择最有效的治疗方案进行治疗。目前，针对病原真菌感染的治疗策略较为单一，即主要选用唑类药物。该类药物能阻断真菌生长所必需的麦角甾醇的合成，对不同种类的病原真菌均具有良好的抑菌效果。因此，及时有效的诊断出病原真菌类型的感染，在此基础上进行药物干预，对于提高抗真菌药物的治疗效果、降低病原真菌感染的危害具有重要意义。 尽管病原真菌在临床感染中处于极为重要的地位，但迄今临床对该类真菌的鉴定仍是基于平板培养的形态学方法。这种传统方法存在操作步骤多、检测所需时间长、结果存在不确定性等问题。由于真菌通常比临床病原细菌具有更为缓慢的生长速率，一般的真菌培养结果需要2-6天时间才能有明确的结果。然而，临床上有很多感染患者，尤其是重症特护人群迫切需要快速的检测手段，以明确所感染病原菌的种类，便于临床医师尽快选用有效的抗生素进行对症治疗。尤其是对于念珠菌属、曲霉属等病原真菌而言，其引起的播散性感染往往危及患者生命，因此，研制针对这类真菌的快速、高效、准确的检测方法显得尤为重要。 近年来，由于生命科学的迅猛发展，各种各样的检测方法层出不穷。如基因探针检测法，聚合酶链反应法，电阻电导检测法，微量热法，免疫磁性微球法等一系列理化和免疫学方法。 但是，在实际检测中也还存在着不少问题，使这些方法都未得到大规模临床应用，主要问题有：操作复杂、对仪器要求高、测试时间相对较长、费用较高等等。因此，开发新型的快速、高效、准确、便捷的检测方法具有极为重要的意义。免疫检测是近年来迅速发展起来的病原微生物诊断方法，具有高效、特异性强、操作简单等诸多优点，因而日益受到关注。值得注意的是，病原真菌表面均存在结构类似的甘露糖蛋白表面抗原，这为制备具有针对各种病原真菌的广谱免疫诊断试剂提供了可能。然而，迄今尚未见有针对所有病原真菌的免疫诊断试剂的报道。
技术实现思路
本专利技术目的是为了解决现有技术中存在的操作复杂、对仪器要求高、测试时间相对较长、费用较高等问题，而提供一种快速检测人类病原真菌感染的免疫荧光诊断试剂及其制备方法。 本专利技术中所制备的人类病原真菌免疫荧光诊断试剂，是以引发浅层感染或系统性感染的病原真菌为抗原，制备单克隆抗体或多克隆抗体，该抗体与粒径0.1- 10 nm的荧光纳米材料经缩合连接为荧光纳米量子点-抗体复合物，既可直接用于检测固定在载体材料上的未知抗原，又能将荧光纳米量子点-抗体复合物包被在载体材料上，进而检测未知抗原，所述的载体材料为硝酸纤维素制备的膜材、片材或棒材；或PVC材料制备的24孔板或96孔板，或平皿，或反应碟。荧光纳米量子点材料激发光波长为200 nm - 700nm。 一种人类病原真菌感染免疫荧光诊断试剂的制备方法，其步骤为： 第1、.制备抗体第1.1、取临床病原真菌感染患者病样标本，分离病原真菌抗原标准株，确定其菌属性；第1.2、扩大病原真菌的培养，制备可溶性抗原；并以该抗原为致敏源，免疫动物，制备特异性多克隆抗体，或利用体外培养细胞融合技术制备特异性单克隆抗体；第2、荧光纳米量子点材料和抗体的酰胺脱水缩合第2.1、.将粒径0.1- 10 nm荧光纳米量子点材料溶于无离子水，制成2 mg /1ml浓度的荧光纳米量子点溶液；第2.2、.另将1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺（EDC）与无离子水按1 g /1ml浓度比的EDC溶液200 μl与上述第2.1步中的荧光纳米量子点溶液200 μl混合(EDC:量子点材料 = 500:1)后，于4℃摇床反应15-20 分钟，再加入0.5 mg NHSS/1ml无离子水浓度的NHSS溶液200 μl反应30分钟；第2.3、.然后在上述反应体系中加入第1步制备、1 mg/ml的纯化抗体100-150 μl反应，置于4℃摇床过夜，即得到酰胺脱水缩合后的荧光纳米量子点-抗体复合物溶液，并可直接用于对未知抗原的检测或包被于载体材料。该方法适用于各类动物抗体与纳米量子点材料的缩合反应。所述的荧光纳米量子点材料是非金属量子点荧光材料、金属量子点荧光材料或贵金属纳米团簇荧光材料，荧光纳米量子点的粒径：0.1- 10 nm。激发光波长为200 – 700 nm波长范围内的自发荧光物质或人工合成的荧光物质。荧光发光色为蓝色、绿色、黄色、橙色或红色。 本专利技术的优点和有益效果：本专利技术提供的人病原真菌感染免疫荧光诊断试剂，具有对所有病原真菌感染的疾病检测特异性强、适用于所有未知病原真菌、性质稳定；操作使用便捷，检测快速、准确、检测时间短等特点。有效的指导临床医生准确用药，减少抗生素滥用，降低患者的诊断检测及治疗费用。从而产生良好的经济效益和社会效益。 附图说明图1 临床分离菌株的形态学特征。 图2 临床分离菌株18S rDNA的系统发育树示意图。 图3 临床多种分离菌株的免疫荧光检测结果。 图4 临床标本的免疫荧光检测结果。 具体实施方式下面结合附图及实施例对本专利技术进行详细的说明。 实施例1 （1）菌株分离：为检验科经口腔念珠菌病感染患者痰液中采集的病原真菌标本。经科玛嘉培养基平板划线培养48 h获得标准菌株。该菌株的形态学特征见图1。在YPD培养基中，该菌呈酵母形态；在添加10%血清的YPD培养基中，细胞转变为菌丝形态。因此初步证实该菌株为白念珠菌。（2）菌株分子生物学鉴定： 采用玻璃珠振荡法，提取菌株的基因组；采用真菌18S rDNA通用扩增引物18SF (5’- TACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3’) 及18SR (5’-CCTTGTTACGACTTTTACTT -3’)，从菌株基因组上扩增18S rDNA序列。将所扩增序列克隆至pMD19-T simple载体（Takara，中国），PCR检测转化子。挑取正确转化子，采用M13F-47 (5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)及M13-48 (5’-GAGCGGATAACAATTT CACACAGG-3’)，对插入片段进行双向测序。采用DNAMAN软件对双向序列进行拼接，得到菌株的18S rDNA序列。通过本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人病原真菌感染免疫荧光诊断试剂，其特征在于：以引发浅层感染及系统性感染的临床病原真菌为抗原，制备多克隆抗体或单克隆抗体，该抗体与粒径0.1‑10 nm的荧光纳米量子点材料缩合形成荧光纳米量子点‑抗体复合物，既能直接用于检测固定在载体材料上的未知抗原，又能将荧光纳米量子点‑抗体复合物包被在载体材料上，进而检测未知抗原；所述荧光纳米量子点材料激发光波长为200–700 nm。
【技术特征摘要】
1.一种人病原真菌感染免疫荧光诊断试剂，其特征在于：以引发浅层感染及系统性感染的临床病原真菌为抗原，制备多克隆抗体或单克隆抗体，该抗体与粒径0.1-10 nm的荧光纳米量子点材料缩合形成荧光纳米量子点-抗体复合物，既能直接用于检测固定在载体材料上的未知抗原，又能将荧光纳米量子点-抗体复合物包被在载体材料上，进而检测未知抗原；所述荧光纳米量子点材料激发光波长为200–700 nm。
2.根据权利要求1所述的人病原真菌感染免疫荧光诊断试剂，其特征在于：所述的载体材料为硝酸纤维素制备的膜材、片材或棒材；或PVC材料制备的24孔板或96孔板，或平皿，或反应碟。
3.如权利要求1所述的人病原真菌感染免疫荧光诊断试剂的制备方法，其特征包括：
第1、.制备抗体
第1.1、取临床病原真菌感染患者病样标本，分离病原真菌抗原标准株，确定其菌属性；
第1.2、扩大病原真菌的培养，制备可溶性抗原；并以该抗原为致敏源，免疫动物，制备特异性多克隆抗体，或利用体外培养细胞融合技术制备特异性单克隆抗体；
第2、荧光纳米量子点材料和抗体的酰胺脱水缩合
第2.1、.将粒径0.1- 10 nm荧光纳米量子点材料溶于无离子水，制成2 mg /1ml浓度的荧光纳米量子点溶液；
第2.2、.另将1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺...
【专利技术属性】
技术研发人员：李明春，陈家童，喻其林，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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