本发明专利技术涉及一种猪FTO基因A227G碱基突变的检测方法及应用，属基因工程技术领域。根据GenBank数据库猪FTO基因序列设计特异性引物，对待检测猪基因组进行PCR扩增；分离、纯化扩增产物，获得特异核酸；使用限制性内切酶HhaI，对PCR扩增产物进行RFLP（酶切）分析，根据酶切后PCR产物的琼脂糖电泳条带，判断待检猪是否存在A227G单核苷酸碱基突变。且该突变中的A等位基因可应用于猪育种生产中，为提高猪产仔数的有利等位基因。本发明专利技术对提高猪产仔数的分子育种提供依据，同时为猪的早期胚胎丢失机理研究提供基因工程技术帮助。
【技术实现步骤摘要】
-种猪FTO基因编码区A227G单碱基突变的检测方法及应 用 1所属
本专利技术涉及一种猪FTO基因编码区单核苷酸突变（A227G碱基突变）的检测方法 及应用，属基因工程
。用此方法，能快速检测到猪FTO基因的单核苷酸碱基突变， 为猪产仔数性状的分子育种研究提供帮助。 2
技术介绍
猪产仔数是一个重要的繁殖性状和经济性状，而影响猪产仔数的一个关键因素是 胚胎附植，因为很多的胚胎在这个过程中死亡，而这些胚胎的死亡是导致产仔数下降的一 个重要原因。 脂肪肥胖相关基因（fatmassandobesityassociatedgene,FT0)是 2007 年发 现的与人类肥胖相关的基因，在人类和小鼠上的研究表明该基因在控制食欲和能量消耗方 面具有重要作用。 除了影响脂肪代谢以外，FTO还影响机体的繁殖性能。人和大鼠中的研究表明，胎 盘组织中的FTO基因在子宫内环境与胎儿生长发育之间发挥了桥梁作用；在小鼠中，原位 杂交和Real-timeqPCR的结果表明，FTO在胚胎组织中表达量很高；在山羊中，研究发现妊 娠第110天时，胎盘组织中的FTO表达与胎儿体重有很强的相关性；在荷斯坦牛中，FTO多 态性影响乳脂。本人前期研究发现，FTO在猪的繁殖组织中也有很高的表达量，推测其可能 影响猪的繁殖活动，从而进一步影响猪产仔数。 针对猪FTO基因碱基突变的检测技术较多，包括PCR-RFLP、PCR-SSCP、基因组直接 测序、实时荧光定量PCR技术等。较常规简易的实施方式为： 1)检索GenBank数据库中猪FTO基因的序列，以该序列为模板，应用Oligo， Primer等生物软件设计引物，进行PCR扩增。 2)对PCR反应体系和条件进行优化，检测产物浓度和质量。 3)应用胶回收试剂盒，对PCR产物进行回收、纯化。 4)对纯化的PCR产物进行测序，然后用DNAMAN等核酸分析软件比对各样本PCR产 物序列，寻找单核苷酸碱基突变。 5)利用生物信息学方法分析碱基突变是否引起编码氨基酸和蛋白结构的变化。 目前有关猪FTO基因影响猪产仔数的报道还未有报道。鉴于FTO在动物繁殖活 动过程中的生物学功能，本专利技术根据GenBank数据库猪FTO基因cDNA序列设计引物，扩 增出含A227G位点的PCR产物，并寻找到合适的限制性内切酶对192头母猪基因组进行了 PCR-RFLP和测序分析，最后将A227G位点基因型与猪产仔数进行了关联分析，利用猪FTO基 因碱基突变的检测技术找到了猪高产仔数的有利等位基因。这些结果将为猪产仔数分子育 种提供基因工程技术帮助。 3
技术实现思路
技术问题 本专利技术的目的在于提供一种猪FTO基因A227G碱基突变的检测及应用方法，有助 于研究猪FTO基因的分子结构、功能及应用，为猪高产仔数的分子育种提供依据。 技术方案 一种猪FTO基因编码区A227G单碱基突变的非诊断的检测方法，其特征在于如下 步骤： 1)据GenBank数据库猪FTO基因序列设计特异引物：正义引物 5' -TACCCTAAGCTAATTCTCCGA-3'反义引物 5 ' -GAGATACTGGCGTGAGCAAA-3 ' 应用上述引物对待检测猪基因组进行PCR扩增，PCR扩增产物长度152bp;2)使用限制性内切酶HhaI，对PCR扩增产物进行RFLP酶切分析，酶切位点如下， 5, · · ·GCGIC. · · 3,， 3' · · ·CIGCG. · · 5' ：序列中的I为酶切位置 使用HhaI内切酶对上述PCR产物（152bp)进行RFLP(酶切）分析，根据酶切后 PCR产物的琼脂糖电泳条带的条数和大小，判断待检猪FTO基因A227G单核苷酸碱基突变 的基因型：只有一条152bp条带的为AA基因型（无突变型）、有两条条带（152bp和78bp) 的为AG基因型（突变杂合型）、只有一条78bp的为GG基因型（完全突变型）（图2)。 所述一种猪FTO基因编码区A227G单碱基突变的非诊断的检测方法，其特征在 于： (1) 15μLPCR反应体系：10Xbufferl· 5μL，lOmmol/L的dNTPmixO. 5μL，IOpmoL/ μL的上下游引物各 0· 5μL，IOU/μL的Taq酶 0· 5μL，50ng/μL的模板DNAL0μL，ddH20 和ddH2010· 5μL。 (2#〇?反应程序：941：预变性51^11;35个循环：941：变性308、601：退火308、721： 延伸30s;72°C终延伸7min;4°C保存； 检测：取3μIPCR产物，加IμIlOXLoadingbuffer于I.5%琼脂糖凝胶电泳检 测。 其中，扩增片段长度为152bp。 所述一种猪FTO基因编码区A227G单碱基突变的非诊断的检测方法可以在动物育 种方面得到应用，尤其在提高产猪仔数的方面应用，其中=FTO基因A227G位点处，A为猪高 产仔数的有利等位基因，G为不利等位基因。 有益效果：目前有关猪FTO基因影响猪产仔数的报道还未有报道。鉴于FTO在动物繁殖活 动过程中的生物学功能，本专利技术根据GenBank数据库猪FTO基因cDNA序列设计引物，扩 增出含A227G位点的PCR产物，并寻找到合适的限制性内切酶对192头母猪基因组进行了 PCR-RFLP和测序分析，最后将A227G位点基因型与猪产仔数进行了关联分析，利用猪FTO基 因碱基突变的检测技术找到了猪高产仔数的有利等位基因。这些结果将为猪产仔数分子育 种提供基因工程技术帮助。本专利技术根据GenBank数据库猪FTO基因序列设计引物，对中外不同品种猪FTO基因全长编码序列进行特异性PCR扩增，找寻可能存在的单核苷酸碱基突变，并对FTO的 A227G位点基因型与猪产仔数进行了关联分析，并寻找到该位点有利等位基因A。本专利技术针 对猪FTO基因编码区的筛查，检测到A227G单核苷酸碱基突变，虽然没有直接引起编码氨基 酸的改变，但与其连锁不平衡的分子标记可能会引起氨基酸的改变。 本专利技术将为猪产仔数性状的分子育种研究提供基因工程技术帮助。 本专利技术通过研究，确定了检测猪FTO基因编码区A227G碱基突变合适的特异性引 物序列，优化的PCR扩增体系及反应条件，明确了猪FTO基因有效的单核苷酸突变碱基及相 应的编码氨基酸改变，分析碱基突变异致的编码氨基酸及蛋白活性、基因功能的改变，并找 到了FTOA227G突变位点的有利等位基因A，有望使该位点成为猪产仔数育种的分子遗传 记。 4【附图说明】 图1本专利技术实施的不同猪血液组织样提取的基因组的琼脂糖凝胶电泳图谱 图2FT0基因A227G突变位点的PCR扩增产物琼脂电泳结果 图3突变位点测序结果示例 5【具体实施方式】 本专利技术一种猪FTO基因编码区A227G单碱基突变的检测方法应用范围广，任何品 种猪都可以用来检测。 下面结合实施例进一步阐述本专利技术。本实施例仅用于解释本专利技术便不限于本专利技术 范围。实施例中未注明的具体实验条件和方法，通常按照分子克隆实验手册和制造厂商建 议条件。 实施例1猪FTO基因组的获取及引物设计 用高盐法提取192头猪（品种为苏钟猪，公知公用）血液中的基因组，紫外分光光 度计和琼脂糖电泳技术分别检测其浓度本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪FTO基因编码区A227G单碱基突变的非诊断的检测方法，其特征在于如下步骤：1)据GenBank数据库猪FTO基因序列设计特异引物：正义引物5’‑TACCCTAAGCTAATTCTCCGA‑3’反义引物5’‑GAGATACTGGCGTGAGCAAA‑3’应用上述引物对待检测猪基因组进行PCR扩增，PCR扩增产物长度152 bp；2)使用限制性内切酶HhaI，对PCR扩增产物进行RFLP酶切分析，酶切位点如下，5'...G C G︱C... 3'， 3'...C︱G C G... 5'：序列中的“︱”为酶切位置使用HhaI内切酶对上述PCR产物152 bp进行RFLP酶切分析，根据酶切后PCR产物的琼脂糖电泳条带的条数和大小，判断待检猪FTO基因A227G单核苷酸碱基突变的基因型: 只有一条152 bp条带的为AA基因型,为无突变型;有两条条带152 bp和78 bp的为AG基因型,为突变杂合型;只有一条78 bp的为GG基因型,为完全突变型。
【技术特征摘要】
1. 一种猪FTO基因编码区A227G单碱基突变的非诊断的检测方法，其特征在于如下步 骤： 1) 据GenBank数据库猪FT0基因序列设计特异引物： 正义引物 5' -TACCCTAAGCTAATTCTCCGA-3' 反义引物 5 ' -GAGATACTGGCGTGAGCAAA-3 ' 应用上述引物对待检测猪基因组进行PCR扩增，PCR扩增产物长度152 bp ; 2) 使用限制性内切酶Hhal，对PCR扩增产物进行RFLP酶切分析，酶切位点如下， 5, · · · G C G | C…3,， 3'. . . C | G C G. . . 5' ：序列中的 Γ为酶切位置 使用Hhal内切酶对上述PCR产物152 bp进行RFLP酶切分析，根据酶切后PCR产物的 琼脂糖电泳条带的条数和大小，判断待检猪FT0基因 A227G单核苷酸碱基突变的基因型： 只有一条152 bp条带的为AA基因型，为无突变型； 有两条条带152 bp和78 bp的为AG基因型，为突变杂合型； 只有一条78 bp的为GG基因型，为完全突变型。2. 根据权利要求1所述一种猪FT0基因编码区A227...
【专利技术属性】
技术研发人员：付言峰，李兰，任守文，方晓敏，李碧侠，王学敏，周艳红，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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