一种老鸦柿组织培养与快速繁殖的方法技术

本发明专利技术公开了一种老鸦柿组织培养与快速繁殖的方法，依次包括以下步骤：（1）老鸦柿外植体的选择和消毒：（2）丛生芽的诱导：（3）不定芽的增殖：将上一步获得的不定芽丛切成不定芽芽块，接种到添加有6-BA0-3.0mg/L，IBA0-5.0mg/L，叶酸0-2.0mg/L，CH0-0.5mg/L，PVP1.0-2.0g/L的Nitsch培养基中；（4）再生植株的生根培养；（5）再生植株的炼苗和移栽。在上述步骤中采用了不同成分及配比的培养基。采用本发明专利技术的方法，能够快速地获得老鸦柿植株，利于产业化生产。采用本发明专利技术方法，老鸦柿丛生芽的诱导率高达73.5%，不定芽增殖率可达7.75%，植株移栽成活率可达95%以上。

【技术实现步骤摘要】
一种老鸦柿组织培养与快速繁殖的方法
本专利技术属于植物培养
，具体涉及一种老鸦柿组织培养与快速繁殖的方 法。
技术介绍
老鸦柿（rAoWi/b/ia Hemsl.)，别名山柿子、野山柿、野柿子、糯米饭 刺、苦李等，为柿树科柿属落叶小乔木或灌木，分布于安徽、浙江、福建和广东。根或枝入药， 又名牛奶柿、丁香柿、月月有、枝柿、丁季李、拳李、糯米饭刺。其性平，味苦涩，具清湿热、利 肝胆、活血化瘀之功效，主治肝硬化、急性黄疸型传染性肝炎、骨结核和跌打损伤。其果实可 提取柿漆，供涂漆鱼网、雨具等用。实生苗可作柿树的砧木。由于成熟果实桔红色，且可挂果 很久，观赏价值高，台湾、韩国、日本等地引种商品化后也有称之为老爷柿、老鸭柿、姬柿等。 目前老鸦柿的繁殖采用种子繁殖，存在着繁殖系数低、繁殖周期长的缺点，因此建立老鸦柿 的组培快繁体系，是实现其产业化生产的又一有效途径。 目前对于柿科柿属开展的组织培养都是针对于不同品种的柿树⑵ 展开的，老鸦柿的组织培养还没有人报道。且大部分柿树组培研究结果表明1/2MS 培养基和1/2 (NH4NO3, KNO3)的改良MS培养基最适合柿使用。在柿组织培养中，常用的 外植体为芽，有些报道中也提到用嫩枝梢尖、茎段和幼叶。外植体类型对培养效果的影响 是存在品种差异性。Burch等以平核无的芽、茎段和顶端分生组织（0.5-1 mm)为外植体 进行培养时，发现三者形成的有效新梢率存在明显差异，其中芽的为62%，茎段只有10%， 而顶端分生组织则不能成活。Fukui等对西村早生梢尖的采集时期进行了研究，结果表 明6月份为梢尖外植体的最佳采集期，其新梢的增殖生长以及叶分化情况都明显好于其 它月份。大部分报道均认为ZT (玉米素）对促进柿外植体的生长分化效果最好，对于新 梢的伸长生长起着不可缺少的作用。关于生长素在生根培养中的作用效果，一些相关报道 的结论存在一定差异。个别资料表明生长素对柿组培苗的生根并不是必需的。如Burch等 对平核无进行生根培养时发现生长素的有无并不重要，而培养基中是否含有活性炭（AC) 才是生根的关键。大部分资料的结论却与此相反。有研究表明，生长素的最佳使用类型及 浓度为：直接加入培养基中I mg/L IAA ;柿是含酚类物质较多的植物，因此在离体繁殖过 程中容易产生褐变现象。研究表明，配合使用ZT和IAA、使用PVP等措施可减轻褐化，但也 有PVP效果不明显的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种成活率高，利 于实现产业化生产的老鸦柿组织培养与快速繁殖的方法。 为实现本专利技术之目的，采用以下技术方案予以实现：一种老鸦柿组织培养与快速 繁殖的方法，依次包括以下步骤： (1)老鸦柿外植体的选择和消毒：取4-10月的老鸦柿新抽出的枝条，根据各枝条的木 质化的程度将它们分为轻度、中度和高度的茎段；将这些枝条切成带腋芽的茎段，先用刷子 于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2-4 min，用流水冲洗0.5 h后，在超净 台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次后，转入5%的次氯酸钠 溶液中浸泡15 min，无菌水冲洗3次，后转入滴加了 2滴吐温-20的0. 1% HgCl2溶液内浸 泡消毒13-14 min，用无菌水冲洗3次，以正常的极性方向接种到添加有GA3 0.1 mg/L，TDZ 0. 5 mg/L，6-BA 1.0 mg/L的Nitsch培养基中，此培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂 添加量为7 g/L，pH为5. 8-6. 0,培养基曾于121°C下高温高压灭菌20 min。培养温度为 (25±1)°C，光照时间为 14 h 光/10 h 暗，光照强度 30-40 iim〇V(m2 ? s); (2) 丛生芽的诱导 取7-8月中度木质化的新梢茎段，于冰箱内4°C处理2 h，先用牙刷于自来水下轻柔刷 洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2-4 min，用流水冲洗0.5 h后，在超净台里将茎段转入70% 的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次后，转入5%的次氯酸钠溶液中浸泡15 min，无 菌水冲洗3次，后转入滴加了 2滴吐温-20的0. 2% HgCl2溶液内浸泡消毒8-9 min，用无 菌水冲洗3次，以正常的极性方向接种到添加GA3 0. 1-0. 5 mg/L，TDZ 0. 1-2. 0 mg/L，6-BA 0-3.0 mg/L，叶酸 0-2.0 mg/L，CH 0-0.5 mg/L，PVP 0-2.0 g/L 的 Nitsch 培养基内。培养 基中蔗糖浓度为3%，琼脂浓度为0.7%，pH 5. 8-6. 0，121°C下高温高压灭菌20 min，培养 温度为（25±1)°C，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 iim〇V(m2 ? s); (3) 不定芽的增殖 将上一步诱导获得的不定芽丛切成2-3株不定芽的芽块，接种到添加有6-BA 0-3. 0 mg/L，IBA 0-5. 0 mg/L，叶酸 0-2. 0 mg/L，CH 0-0? 5 mg/L，PVP I. 0-2. 0 g/L 的 Nitsch 培 养基中； (4) 再生植株的生根培养 切取叶片嫩绿、生长旺盛且2?3 cm高的不定芽，插入到12. 5%-100% Nitsch，NAA 0-1.0 mg/L，IBA 0-2.0 mg/L，AC 0-2.0 mg/，椰子汁 0-300 g/L 的生根培养基中； (5) 再生植株的炼苗和移栽 待生根的组培苗的苗高长至5 cm以上，根长超过5 cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中 注入少量清水，扣上瓶盖，12 h后挪开一半瓶盖，再过12 h，移走瓶盖，让灯光直照再生植株 培养2 d。然后将培养基捣碎，拿出再生植株，用水将残留的琼脂洗净，将植株定植于珍珠 岩、泥炭的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制 在24-28°C之间。待新叶长出，即可揭开薄膜并叶面喷雾保持湿润，适应3-5 d后即可移栽 大田中。 作为优选方案：在步骤（2)中的Nitsch培养基内添加有GA3 0? 2 mg/L，TDZ 0? 5 mg/L，6-BA 2. 0 mg/L，叶酸 I. 0 mg/L，CH 0? 2 mg/L，PVP I. 0 g/L。 作为优选方案：在步骤（3)中的Nitsch培养基内添加有6-BA LO mg/L，IBA 0? 5 mg/L，叶酸 I. 0 mg/L，CH 0? 2 mg/L，PVP I. 0 g/L。 作为优选方案：在步骤（4)中的Nitsch培养基内添加有25% Nitsch，NAA 0? I， IBA 0.5 mg/L，AC 0.5 g/L，椰子汁 50-100 g/L。 作为优选方案：步骤（5)中混合基质的珍珠岩、泥炭重量配比为：1 :5。 与现有技术相比较，本专利技术的有益效果是：采用本专利技术的方法，能够快速地获得老 鸦柿植株，利于产业化生产。采用本专利技术方法，老鸦柿丛生芽的诱导率高达73. 5%，不定芽增 殖率可达7. 75,植株移栽成活率可达95%以上。 【本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种老鸦柿组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于依次包括以下步骤：（1）老鸦柿外植体的选择和消毒：取4‑10月的老鸦柿新抽出的枝条，根据各枝条的木质化的程度将它们分为轻度、中度和高度的茎段；将这些枝条切成带腋芽的茎段，先用刷子于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2‑4 min，用流水冲洗0.5 h后，在超净台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次后，转入5%的次氯酸钠溶液中浸泡15 min，无菌水冲洗3次，后转入滴加了2滴吐温‑20的0.1% HgCl2溶液内浸泡消毒13‑14 min，用无菌水冲洗3次，以正常的极性方向接种到添加有GA3 0.1 mg/L，TDZ 0.5 mg/L，6‑BA 1.0 mg/L的Nitsch培养基中，此培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂添加量为7 g/L， pH为5.8‑6.0，培养基曾于121℃下高温高压灭菌20 min；培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30‑40 μmol/(m2·s)；（2）丛生芽的诱导取7‑8月中度木质化的新梢茎段，于冰箱内4℃处理2 h，先用牙刷于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2‑4 min，用流水冲洗0.5 h后，在超净台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次后，转入5%的次氯酸钠溶液中浸泡15 min，无菌水冲洗3次，后转入滴加了2滴吐温‑20的0.2% HgCl2溶液内浸泡消毒8‑9 min，用无菌水冲洗3次，以正常的极性方向接种到添加GA3 0.1‑0.5 mg/L，TDZ 0.1‑2.0 mg/L，6‑BA 0‑3.0 mg/L，叶酸0‑2.0 mg/L，CH 0‑0.5 mg/L，PVP 0‑2.0 g/L 的Nitsch培养基内；培养基中蔗糖浓度为3％，琼脂浓度为0.7％，pH 5.8‑6.0，121℃下高温高压灭菌20 min，培养温度为(25±1)℃，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30‑40 μmol/(m2·s)；（3）不定芽的增殖将上一步诱导获得的不定芽丛切成2‑3株不定芽的芽块，接种到添加有6‑BA 0‑3.0 mg/L，IBA 0‑5.0 mg/L，叶酸0‑2.0 mg/L ，CH 0‑0.5 mg/L，PVP 1.0‑2.0 g/L的Nitsch培养基中；（4）再生植株的生根培养切取叶片嫩绿、生长旺盛且2~3 cm高的不定芽，插入到12.5%‑100% Nitsch，NAA 0‑1.0 mg/L ，IBA 0‑2.0 mg/L，AC 0‑2.0 mg/，椰子汁 0‑300 g/L的生根培养基中；（5）再生植株的炼苗和移栽待生根的组培苗的苗高长至5 cm以上，根长超过5 cm时，松开组培瓶的瓶盖，往瓶中注入少量清水，扣上瓶盖，12 h后挪开一半瓶盖，再过12 h，移走瓶盖，让灯光直照再生植株培养2 d；然后将培养基捣碎，拿出再生植株，用水将残留的琼脂洗净，将植株定植于珍珠岩、泥炭的混合基质中，浇透水并用透明的聚乙烯塑料薄膜覆盖以保温保湿，室内温度控制在24‑28℃之间；待新叶长出，即可揭开薄膜并叶面喷雾保持湿润，适应3‑5 d后即可移栽大田中。...

【技术特征摘要】
1. 一种老鸦柿组织培养与快速繁殖的方法，其特征在于依次包括以下步骤： (1) 老鸦柿外植体的选择和消毒：取4-10月的老鸦柿新抽出的枝条，根据各枝条的木 质化的程度将它们分为轻度、中度和高度的茎段；将这些枝条切成带腋芽的茎段，先用刷子 于自来水下轻柔刷洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2-4 min，用流水冲洗0.5 h后，在超净 台里将茎段转入70%的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次后，转入5%的次氯酸钠 溶液中浸泡15 min，无菌水冲洗3次，后转入滴加了 2滴吐温-20的0. 1% HgCl2溶液内浸 泡消毒13-14 min，用无菌水冲洗3次，以正常的极性方向接种到添加有GA3 0. 1 mg/L，TDZ 0. 5 mg/L，6-BA 1.0 mg/L的Nitsch培养基中，此培养基中的蔗糖添加量为30 g/L，琼脂 添加量为7 g/L，pH为5. 8-6.0,培养基曾于121°C下高温高压灭菌20 min;培养温度为 (25±1)°C，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 ymoVOn2 · s); (2) 丛生芽的诱导 取7-8月中度木质化的新梢茎段，于冰箱内4°C处理2 h，先用牙刷于自来水下轻柔刷 洗，加入适量的洗洁精溶液浸泡2-4 min，用流水冲洗0.5 h后，在超净台里将茎段转入70% 的酒精溶液中浸泡2 min，用无菌水冲洗3次后，转入5%的次氯酸钠溶液中浸泡15 min，无 菌水冲洗3次，后转入滴加了 2滴吐温-20的0. 2% HgCl2溶液内浸泡消毒8-9 min，用无 菌水冲洗3次，以正常的极性方向接种到添加 GA3 0. 1-0. 5 mg/L，TDZ 0. 1-2. 0 mg/L，6-BA 0-3. 0 mg/L，叶酸 0-2. 0 mg/L，CH 0-0· 5 mg/L，PVP 0-2. 0 g/L 的 Nitsch 培养基内；培养 基中蔗糖浓度为3%，琼脂浓度为0.7%，pH 5. 8-6. 0，121°C下高温高压灭菌20 min，培养 温度为（25±1)°C，光照时间为14 h光/10 h暗，光照强度30-40 ymoVOn2 · s); (3) 不定芽的增殖 将上一步诱导获得的不...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙骏威，朱诚，王飞娟，江琼，丁艳菲，蔡冲，
申请(专利权)人：中国计量学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33