【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
,涉及一种危险性实蝇类害虫基因检测芯片及其制备方 法。
技术介绍
实媚科Tephritidae,广泛分布于热带和温带地区,仅仅在高寒和高炜度地区没被 发现。实蝇科的大部分种类为植食性,这其中又大多以水果和蔬菜作物作为寄主植物,许多 实蝇种类都是果蔬生产的重要害虫。这些危险性实蝇类害虫主要集中在果实蝇属,寡鬃实 蝇属,按实蝇属,小条实蝇属和绕实蝇属中,这五个属被认为是实蝇科中最具有经济意义的 类群。实蝇类害虫不仅直接造成作物产量和质量的损失,增加防治成本,而且由于检疫法规 的存在,还会导致出口市场的丢失,进而产生连锁反应形成更大的经济损失。鉴于此,实蝇 类害虫在许多国家都被列为重要检疫对象。 由于实蝇类害虫的幼虫均在果实内取食为害,幼虫老熟后出果化蛹,隐蔽性很强。 如果检疫措施不力,实蝇类害虫极易随果蔬调运和携带传播危害,所以检验检疫在实蝇类 害虫的防治中有着举足轻重的地位。由于检疫过程中通常检到的是实蝇的幼虫,幼虫特 征不明显且分类系统并不完善,按照传统的检疫方法,只能饲养至成虫鉴定,远远不能满 足日益增长的口岸贸易对快速检疫的要求。近年来,包括同工酶电泳,核酸序列分析以及 PCR-RFLP等在内的许多分子生物学技术被用到口岸检疫和鉴定上,大大提高了口岸检疫的 速度和效率。但是这些分子检测方法只是针对一种或几种实蝇种类的鉴定检测方法,而日 益繁忙的口岸检疫往往要求检疫方法尽可能集成化,自动化和低成本化。而基因芯片的高 通量,高自动化和低成本的特点正好符合这些要求。所以将基因芯片技术运用于口岸检 ...
【技术保护点】
一种危险性实蝇类害虫基因检测芯片,其特征在于,该检测检疫性实蝇的基因芯片采用Corning氨基化修饰基片,此基片为玻璃基片,表面已修饰有氨基活性基团;其上固定有用于检测危险性实蝇的寡核苷酸探针,40bp,所述寡核苷酸探针可分别与待测样品进行杂交反应;基片尺寸为25mm×75mm;所述寡核苷酸探针组含选自下述中的至少一种寡核苷酸探针序列:印加按实蝇 GGCAGTATTCGCAATTATAGCTGGATTCATCCACTGATACCCT墨西哥按实蝇 ACACATATAATATACACATAATGACAACATGAGCAGCCCTCGG墨西哥按实蝇 AGCAGTATTCGCAATTATAGCTGGATTTATCCACTGATACCCT暗色实蝇 ACAGTTGGAGGATTAACCGGAGTAATACTTGCTAATTCTTCTG暗色实蝇 GCTACACTTCATGGAACCCAATTAAATTACTCCCCAGCAATAC暗色实蝇 TCTTACATGACACTTACTATGTTGTAGCCCACTTCCATTATGT中美按实蝇 TTCCCAACGACAGGTT ...
【技术特征摘要】
2014.02.14 CN 201410053234.21. 一种危险性实蝇类害虫基因检测芯片,其特征在于,该检测检疫性实蝇的基因芯片 采用Corning氨基化修饰基片,此基片为玻璃基片,表面已修饰有氨基活性基团;其上固定 有用于检测危险性实蝇的寡核苷酸探针,40bp,所述寡核苷酸探针可分别与待测样品进行 杂交反应;基片尺寸为25mmX 75mm ;所述寡核苷酸探针组含选自下述中的至少一种寡核苷 酸探针序列:所述危险性实蝇为:印加按实蝇Anastrepha distincta、墨西哥按实蝇A. ludens、 暗色实蝇A. serpentina、中美按实蝇A. striata、南亚果实蝇Bactrocera tau、瓜实 妮 B. cucurbitae、桃实妮 B. zonata、蒲桃实妮 B. albistrigata、艳实妮 B. calophylli、 桔小实蝇B. dorsalis、普通果实蝇B. caudata、番石槽实蝇B. correcta、油橄榄实蝇 B. oleae、黄瓜果实蝇B. cucumis、大洋洲实蝇B. curvipennis、日本南瓜实蝇B. depressa、 平展实蝇B. expandens、单带果实蝇B. frauenfeldi、扎维斯实蝇B. jarvisi、辣椒实蝇 B. latifrons、黑肩角桔实蝇B. psidii、昆士兰实蝇B. tryoni、三带实蝇B. umbrosa、蜜柑 大实蝇B. tsuneonis、桔大实蝇B. minax、地中海实蝇Ceratitis capitata、非洲芒果实蝇 C. cosyra、黑羽小条实蝇C. anonae、纳塔尔实蝇C. Rosa、非洲芒果实蝇C. cosyra苹果绕实 妮 Rhagoletispomonella、搜桃绕实妮 R. Cerasi。2. -种危险性实蝇类害虫基因检测芯片制备方法,其特征在于,包括以下步骤: (1) 芯片基片的准备 本芯片基片采用Corning氨基化修饰基片,此基片为玻璃基片,表面已修饰有氨基活 性基团;基片尺寸为25mmX75mm; (2) 探针的设计及制备1.探针的设计 探针的设计是基因芯片开发的关键,科学、合理和可靠的探针设计不仅可以提高芯片 的可靠性,还可以降低芯片制作成本;本芯片31种纳入检测分析的实蝇序列片段,除了桔 小实蝇B. dorsalis,桔大实蝇B. minax,瓜实蝇B. cucurbitae,南亚果实蝇B. tau,普通果实 蝇B. caudata,地中海实蝇C. capitata,油榄实蝇B. oleae和昆士兰实蝇B. tryoni的片段 序列是由本实验室扩增测序所得,其余实蝇序列片段均取自NCBI网站的GenBank数据库; 本芯片的探针设计步骤主要分为以下6个步骤:1)探针源序列的确定;2)源序列的收 集与下载;3)对收集到的源序列进行序列比对后,初步确定一批31种实蝇之间的特异性序 列(40bp) ;4)通过Array designer4. 25对特异性序列进行芯片探针质量评估;5)将通过 评估的探针序列进行在NCBI网站进行Blast比对,进一步确定探针的特异性;6)确定最终 探针序列;另外还有质控探针的设计,分为阳性质控探针和阴性质控探针;探针序列信息 见表1 ; 1. 1探针源序列的确定 为了获得最丰富的探针特异性的比对资源,提高基因芯片的可靠性,我们在GenBank 数据库中实蝇序列信息登录相对集中的序列作为探针设计的母版序列;经比对后发现线粒 体细胞色素氧化酶I和细胞色素氧化酶II基因片段是登录最为集中的序列片段;3段序列 作为探针设计的源序列:F,S和DQ,它们的扩增引物序列序列分别为: F 上游引物:5' -TACAGTTGGAATAGACGTTGATAC-3', F 下游引物:5' -TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3' ; S 上游引物:5' -ATGGCAGATTAGTGCAATGG-3', S 下游引物:5' -GTTTAAGAGACCAATACTTG-3' ; DQ 上游引物:5' -ATGGCAGATTAGTGCAATGG-3', DQ 下游引物:5' -ACTGTAAATATATGATGAGCTCA-3' ; 1.2探针源序列的收集与下载 以桔小实蝇的上述3个同源序列作为模板序列,从GenBank数据库中收集下载31种实 蝇的上述3个同源序列;由于F和S序列有重叠,所以将F和S合并为一个连续序列;在收 集和下载源序列时,为了减少不同地理种群之间的序列差异的影响,在对每种实蝇源序列 来源地进行比较的基础上,尽量选取重复性比较高的登录序列作为源序列;31种实蝇中有 些实蝇的3个源序列并不完整,但大部分序列都在源序列内; 桔小实蝇B. dorsalis,桔大实蝇B. minax,瓜实蝇B. cucurbitae,南亚果实蝇B. tau,普 通果实蝇B. caudata,地中海实蝇C. capitata,油榄实蝇B. oleae和昆士兰实蝇B. tryoni 的片段序列由本实验室按下面实验步骤扩增测序所得; 首先提取8种待检测实蝇的总DNA作为扩增模板;如前所述扩增样品所用引物有3对, 第一对为UEA7和UEA10,第二对为SF和SR,第三对为DQF和DGR ; 三对引物的扩增体系是一致的,均为:扩增条件分别为: 扩增片段F,引物对为UEA7和UEAlO的扩增条件为: 1>94°C 5min 2,95°C 40s 3、 48°C 30s 4、 72°C Imin 5,72°C 7min 条件2、3、4 30个循环 扩增片段S,引物对为SF和SR的扩增条件为: U 94°C 3mi...
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