欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因 VlAP17及其应用制造技术

本发明专利技术中公开了一种欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17及其应用。所公开的基因完整开放阅读框序列全长1074bp，编码358个氨基酸。发明专利技术人构建了pCAMBIA2300-35S-VlAP17过量表达载体，通过花絮浸染法将其导入模式植物拟南芥。在拟南芥中过量表达VlAP17明显提高了拟南芥对于渗透胁迫，失水处理，长期干旱以及盐胁迫的耐受力。所公开的应用是基因VlAP17用于提高植株的抗盐胁迫能力和干旱胁迫能力的应用。

【技术实现步骤摘要】
欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17及其应用
本专利技术涉及植物抗逆基因鉴定及基因工程
，特别涉及一个欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17。
技术介绍
天冬氨酸蛋白酶(APs)广泛分布于植物，动物，微生物及病毒中。根据它们的氨基酸序列同源性共分为14个不同的家族，根据它们的进化关系和三维结构又可分为6个不同的分支。植物天冬氨酸蛋白酶分布于AA分支的A1，A3，A11和A12以及AD分支的A22家族。大多数植物天冬氨酸蛋白酶与来源不同的类胃蛋白酶共同属于A1家族。与A1家族的其他成员相似，植物天冬氨酸蛋白酶在酸性pH条件下具有活性，受胃蛋白酶抑制剂的特异抑制，有两个具有催化活性的天冬氨酸残基。目前已从多种植物中检测并纯化出天冬氨酸蛋白酶。然而，它们的生物学功能并没有像哺乳动物、微生物或病毒中的天冬氨酸蛋白酶那样得到很好的表征，在这些物种中天冬氨酸蛋白酶执行多种不同的功能，包括特异的蛋白加工(如：高血压蛋白原酶),蛋白质降解(如：胃酶如凝乳酶，胃蛋白酶和胃亚蛋白酶)或病毒多聚蛋白加工(人体免疫病毒AP)。关于植物天冬氨酸蛋白酶功能的了解来自于假设的蛋白质底物的共定位研究、特定组织或特异条件下的这些底物在离体条件或特异表达下的加工或降解的实验证据。总的来说，植物APs参与不同植物器官的蛋白质加工或降解，以及植物衰老，逆境响应，程序性细胞死亡和再生。在自然生长环境中，植物经常暴露于复杂多变的生物与非生物胁迫中。为了改善植物对胁迫和疾病的抵抗能力，研究各种胁迫途径中抗逆基因的功能是很重要的。但现有的关于AP基因在抗逆方面的研究还很少。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一个欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17，并证明了该基因在抗逆方面的功能。为了实现上述任务，本专利技术采用如下的技术解决方案：一种欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17，其特征在于，该欧美杂交葡萄巨峰抗逆基因VlAP17的编码区序列如SEDIDNO:1所示。本专利技术首次构建了pCAMBIA2300-35S-VlAP17过量表达载体，并通过花絮浸染法将其导入模式植物拟南芥。研究了欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17过量表达的转基因株系和野生对照在渗透胁迫，失水处理，长期干旱以及盐胁迫处理下的生长情况。本专利技术的欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17能明显提高拟南芥对于渗透胁迫，失水处理，长期干旱以及盐胁迫的耐受力。在胁迫条件下，转基因株系中的活性氧(ROS)的积累也是明显少于野生对照,而活性氧清除剂SOD，CAT，POD的酶活性显著高于野生型对照。在含有氯化钠(NaCl)和甘露醇(Mannitol)的培养基上，具有欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17的株系萌发率显著高于野生对照,根长也明显长于对照。以上结果都表明欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17在拟南芥中的过量表达提高了植株的抗盐胁迫和干旱胁迫的能力。附图说明图1是氯化钠和甘露醇引起的渗透胁迫对野生对照(WT)和转基因株系VlAP17-15(L1),VlAP17-33(L2)和VlAP17-43(L3)萌发的影响。其中，A图是在MS培养基上的图片，B图是在MS培养基+130mM的NaCl上的图片，C图是在MS培养基+200mM甘露醇(Mannitol)上的图片，图D是野生对照WT、转基因株系L1,L2,L3在MS培养基，含有130mM氯化钠和200mM甘露醇的渗透培养基上的萌发率，*表示与野生对照相比有显著差异，**表示与野生对照相比有极显著差异(*0.01<P<0.05,**P<0.01)。图2是氯化钠和甘露醇引起的渗透胁迫对野生对照WT、转基因株系L1,L2,L3根系发育的影响。A图是将苗龄5天的野生对照WT、VlAP7转基因株系L1,L2,L3分别移栽到在MS培养基，含有130mM氯化钠和200mM甘露醇的渗透培养基上生长一周后的根系生长图。B图是野生型对照和转基因株系在不同培养基上的根长。C图是野生型对照和转基因株系在不同培养基上的侧根数量，*表示与野生对照相比有显著差异，**表示与野生对照相比有极显著差异(*0.01<P<0.05,**P<0.01)。图3是氯化钠和甘露醇引起的渗透胁迫对野生对照WT、VlAP17转基因株系L1,L2,L3中叶绿素含量，电导率，丙二醛(MDA)含量，内源ABA含量的影响。将苗龄7天的无菌苗从萌发培养基中分别移栽到在MS培养基，含有130mM氯化钠和200mM甘露醇的渗透培养基上生长一周后测定叶片中的叶绿素含量(A图)，电导率(B图)，MDA含量(C图)和内源ABA含量(D图)。*表示与野生对照相比有显著差异，**表示与野生对照相比有极显著差异(*0.01<P<0.05,**P<0.01)。图4是野生对照，转基因株系VlAP17-15(L1),VlAP17-33(L2)和VlAP17-43(L3)的盆栽苗对盐胁迫和干旱胁迫的反应。A图为胁迫处理一周后的植株代表图，a图为对照，b图为200mM氯化钠处理后的植株生长情况，c图为干旱胁迫一周后的植株生长情况，d图为干旱胁迫一周后复水24小时后的植株生长情况。B图是干旱胁迫一周后复水24后野生对照和转基因株系的复活率，*表示与野生对照相比有显著差异，**表示与野生对照相比有极显著差异(*0.01<P<0.05,**P<0.01)。C图是将正常生长条件下的苗龄3周的野生对照和转基因株系的叶片从植株上采集下来放于自然环境中进行失水处理。每隔15分钟称量一次鲜重，失水率通过与初始鲜重之间的差值与初始鲜重之间的比值进行计算。D图是用台盼兰对盐胁迫和干旱胁迫一周后的野生对照和转基因株系中的死细胞进行染色的情况。图5是野生对照，转基因株系VlAP17-15(L1),VlAP17-33(L2)和VlAP17-43(L3)盆栽苗在盐胁迫和干旱胁迫条件下活性氧积累及活性氧清除剂的活性分析。A图是用NBT对超氧化物的阴离子(O2-)进行染色后的叶片代表图。B图是用DAB对过氧化氢(H2O2)进行染色后的叶片代表图。C图是超氧化物歧化酶(SOD)的酶活性，D图是过氧化氢酶(CAT)的酶活性，E图是过氧化物酶(POD)的酶活性，*表示与野生对照相比有显著差异，**表示与野生对照相比有极显著差异(*0.01<P<0.05,**P<0.01)。图6是正常生长条件下的野生对照和转基因株系VlAP17-15(L1),VlAP17-33(L2)和VlAP17-43(L3)盆栽苗的叶片在不同浓度的外源ABA处理后的气孔开张情况。A图是外源ABA处理后的气孔张开情况代表图。B图是外源ABA处理后野生对照和转基因株系叶片上气孔开度的平均值，*表示与野生对照相比有显著差异，**表示与野生对照相比有极显著差异(*0.01<P<0.05,**P<0.01)。图7是胁迫相关基因在野生对照和转基因株系VlAP17-15(L1),VlAP17-33(L2)和VlAP17-43(L3)中的表达情况。A图是用200mM氯化钠处理苗龄四周的成苗一周，采集叶片提RNA并反转录后利用实时定量PCR技术测定胁迫基因表达量。B图是对苗龄四本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17，其特征在于，该基因的编码区序列如SED ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.欧美杂交葡萄品种巨峰抗逆基因VlAP17用于提高拟南芥植株的抗盐胁迫能力和干旱胁迫能力...

【专利技术属性】
技术研发人员：王西平，郭荣荣，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61