用于提高碱性蛋白酶的溶解度的方法技术

提供在液体洗涤剂中表现出提高的溶解度的碱性蛋白酶。由SEQ ID NO:2所表示的氨基酸序列或与其具有80％或更多序列同一性的氨基酸序列组成的突变碱性蛋白酶，其中选自SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的预定位置或与其相对应的位置处的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基被取代。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于提高碱性蛋白酶的溶解度的方法
本专利技术涉及用于提高碱性蛋白酶在液体洗涤剂中的溶解度的方法。
技术介绍
蛋白酶已经在工业领域使用很长一段时间，并应用到极为广泛种类的产品，例如包括织物洗涤剂的洗涤剂、纤维改良剂、皮革处理剂、化妆品、沐浴盐、食品改良剂和医药产品。其中，工业上最大量地制造的是用于洗涤剂的蛋白酶。例如，通常已知的是Alcalase、Savinase(注册商标；Novozymes)、Maxacal(注册商标；Genencor)、BLAP(注册商标；Henkel))和KAP(KaoCorp.)。将蛋白酶添加到洗涤剂的目的是使主要由蛋白质构成的、附着到衣物材料上的污渍分解为低分子物质，从而加速表面活性剂的增溶。然而，污渍实际上是复合物，其不仅含有蛋白质，而且含有多个组分，包括组合的有机物质和无机物质(例如源自皮脂的脂质和固体颗粒)。然后，已经开发出对复合污渍(即不仅含有蛋白质，而且含有皮脂和其他物质)表现出优异洗涤性能的分子量为约43,000的碱性蛋白酶并申请了专利(参见专利文件1)。该碱性蛋白酶与枯草杆菌蛋白酶(其为常规已知的源自芽孢杆菌属细菌的丝氨酸蛋白酶)不同，具有不同的分子量、初级结构和酶学性质，并且与枯草杆菌蛋白酶尤其不同的是碱性蛋白酶具有极强的抗氧化性。因此，提议将碱性蛋白酶分类到新的枯草杆菌蛋白酶亚族中(非专利文件1)。洗涤剂可基于其形式而分为粉末洗涤剂和液体洗涤剂。液体洗涤剂与粉末洗涤剂相比具有优异的溶解性。液体洗涤剂具有优点，因为未稀释的液体洗涤剂可以直接施用于污渍上。另外，近来，通过使用一半量而与常规液体洗涤剂起等同作用的液体洗涤剂(所谓的浓缩液体洗涤剂)已市售可得。由于这样的浓缩液体洗涤剂包含在小容器内，其不需要大的储存空间或大量用于运输的燃料。除了这些优点之外，基于洗涤机制的彻底重新考虑，一些产品显示出改善的漂洗性能。以这种方式，可以减少洗衣所需的时间，并且可以节省所需的水。为了恒定地保持含酶液体洗涤剂的预定的酶活性，需要使液体洗涤剂中溶解的酶例如蛋白酶稳定。此外，为了增强洗涤剂的去污力，期望的是将酶尽可能多地加入到洗涤剂中。然而，众所周知，技术上难以稳定地将酶与液体洗涤剂混合。例如，在常温下将酶储存在液体中容易引起蛋白质的变性。此外，表面活性剂、脂肪酸、溶剂和其他物质包含在液体洗涤剂中并且其pH为弱碱性。因此，液体洗涤剂对于酶是极其严酷的环境条件。此外，蛋白酶是蛋白水解酶。因为该特征，蛋白酶遭受自身消化，这进一步使得难以将蛋白酶稳定地储存在液体洗涤剂中。此外，浓缩液体洗涤剂(与常规液体洗涤剂相比是浓缩的)的低水含量使得难以溶解大量的酶。作为在液体洗涤剂中稳定地保持酶活性的技术，已知的是添加酶稳定剂，例如钙离子、硼砂、硼酸、硼化合物、羧酸如甲酸、和多元醇。此外，已经研究了通过抑制蛋白酶活性来克服自身消化。已经报道了通过4-取代的苯基硼酸(专利文件2)和通过某种肽醛和硼组合物(专利文件3)可逆抑制蛋白酶而使蛋白酶稳定的方法。而且，据报道，用右旋糖酐化学改性的蛋白酶的稳定性可以在含有表面活性剂的水溶液中得到改善(非专利文件2)。此外，关于表面活性剂稳定性提高的蛋白酶突变体也是已知的(专利文件4至6)。相比之下，目前还没有开发出用于提高酶关于液体洗涤剂的溶解度的技术。引用列表专利文件[专利文件1]WO99/18218A[专利文件2]JP-A-11-507680[专利文件3]JP-A-2000-506933[专利文件4]JP-A-2009-034062[专利文件5]JP-A-2009-034063[专利文件6]WO2010/126156A非专利文件[非专利文件1]Saeki等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,279,313-319,2000.[非专利文件2]Cosmetics&Toiletriesmagazine,111,p79-88,1996.
技术实现思路
更具体地，在一个实施方式中，本专利技术提供提高碱性蛋白酶在液体洗涤剂中的溶解度的方法，该方法包括，在由SEQIDNO:2所表示的氨基酸序列或与其具有80％或更多同一性的氨基酸序列组成的碱性蛋白酶中，将选自SEQIDNo:2所表示的氨基酸序列的表1-1和表1-2的列(i)中所述的位置或与其相对应的位置处的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基用表1-1和表1-2的列(ii)中所述的氨基酸残基取代。[表1-1](i)位置(ii)氨基酸残基(A)405亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸或缬氨酸(B)81亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺(C)40异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸或色氨酸(D)191亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸或色氨酸(E)59缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸(F)11甘氨酸、天冬酰胺或丝氨酸(G)16异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或色氨酸(H)20丙氨酸(I)22色氨酸(J)23天冬酰胺(K)37苏氨酸(L)41异亮氨酸(M)52甘氨酸或丝氨酸(N)53丙氨酸、异亮氨酸或缬氨酸(O)56缬氨酸(P)60苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或色氨酸(Q)63天冬氨酸或亮氨酸(R)80丙氨酸或组氨酸(S)82谷氨酰胺(T)91半胱氨酸(U)100苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或色氨酸(V)101苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸(W)109苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸(X)113亮氨酸或色氨酸(Y)120苯丙氨酸、异亮氨酸、色氨酸或酪氨酸(Z)135亮氨酸(AA)140苯丙氨酸、亮氨酸或色氨酸(AB)151苯丙氨酸(AC)166苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或色氨酸(AD)194酪氨酸(AE)200色氨酸(AF)204异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸(AG)212亮氨酸、缬氨酸或色氨酸[表1-2](i)位置(ii)氨基酸残基(AH)233异亮氨酸、亮氨酸或色氨酸(AI)238亮氨酸(AJ)243异亮氨酸、亮氨酸或酪氨酸(AK)246苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸(AL)275苯丙氨酸、亮氨酸或色氨酸(AM)277苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸(AN)297苯丙氨酸、亮氨酸或色氨酸(AO)326色氨酸(AP)330苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸(AQ)332甘氨酸、苏氨酸或缬氨酸(AR)334亮氨酸(AS)342谷氨酸、亮氨酸、苏氨酸或色氨酸(AT)343苏氨酸(AU)357亮氨酸(AV)359苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或甘氨酸(AW)361异亮氨酸、缬氨酸或色氨酸(AX)376色氨酸(AY)378亮氨酸或色氨酸(AZ)385甲硫氨酸、脯氨酸或酪氨酸(BA)386丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸(BB)387苯丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或色氨酸(BC)390苯丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸(BD)393谷氨酰胺(BE)396甘氨酸(BF)403赖氨酸或苏氨酸(BG)406苯丙氨酸、缬氨酸或色氨酸(BH)407半胱氨酸或甘氨酸(BI)408异亮氨酸、天冬酰胺、色氨酸或酪氨酸(BJ)409色氨酸或酪氨酸(BK)411丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸或缬氨酸(BL)427缬氨酸(BM)433亮本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高碱性蛋白酶在液体洗涤剂中的溶解度的方法，所述方法包括，在由SEQ ID NO:2所表示的氨基酸序列或与其具有80％或更多同一性的氨基酸序列组成的碱性蛋白酶中，将选自SEQ ID No:2所表示的氨基酸序列的表1‑1和表1‑2的列(i)中所述的位置或与其相对应的位置处的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基用表1‑1和表1‑2的列(ii)中所述的氨基酸残基取代。[表1‑1] (i)位置(ii)氨基酸残基(A)405亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸或缬氨酸(B)81亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸或谷氨酰胺(C)40异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸或色氨酸(D)191亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸或色氨酸(E)59缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸(F)11甘氨酸、天冬酰胺或丝氨酸(G)16异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或色氨酸(H)20丙氨酸(I)22色氨酸(J)23天冬酰胺(K)37苏氨酸(L)41异亮氨酸(M)52甘氨酸或丝氨酸(N)53丙氨酸、异亮氨酸或缬氨酸(O)56缬氨酸(P)60苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或色氨酸(Q)63天冬氨酸或亮氨酸(R)80丙氨酸或组氨酸(S)82谷氨酰胺(T)91半胱氨酸(U)100苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或色氨酸(V)101苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸(W)109苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸(X)113亮氨酸或色氨酸(Y)120苯丙氨酸、异亮氨酸、色氨酸或酪氨酸(Z)135亮氨酸(AA)140苯丙氨酸、亮氨酸或色氨酸(AB)151苯丙氨酸(AC)166苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或色氨酸(AD)194酪氨酸(AE)200色氨酸(AF)204异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸(AG)212亮氨酸、缬氨酸或色氨酸[表1‑2] (i)位置(ii)氨基酸残基(AH)233异亮氨酸、亮氨酸或色氨酸(AI)238亮氨酸(AJ)243异亮氨酸、亮氨酸或酪氨酸(AK)246苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸(AL)275苯丙氨酸、亮氨酸或色氨酸(AM)277苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸(AN)297苯丙氨酸、亮氨酸或色氨酸(AO)326色氨酸(AP)330苯丙氨酸、甲硫氨酸或色氨酸(AQ)332甘氨酸、苏氨酸或缬氨酸(AR)334亮氨酸(AS)342谷氨酸、亮氨酸、苏氨酸或色氨酸(AT)343苏氨酸(AU)357亮氨酸(AV)359苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或甘氨酸(AW)361异亮氨酸、缬氨酸或色氨酸(AX)376色氨酸(AY)378亮氨酸或色氨酸(AZ)385甲硫氨酸、脯氨酸或酪氨酸(BA)386丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸(BB)387苯丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、缬氨酸或色氨酸(BC)390苯丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸(BD)393谷氨酰胺(BE)396甘氨酸(BF)403赖氨酸或苏氨酸(BG)406苯丙氨酸、缬氨酸或色氨酸(BH)407半胱氨酸或甘氨酸(BI)408异亮氨酸、天冬酰胺、色氨酸或酪氨酸(BJ)409色氨酸或酪氨酸(BK)411丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸或缬氨酸(BL)427缬氨酸(BM)433亮氨酸...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.04.10 JP 2012-089482;2013.02.21 JP 2013-031991.一种提高碱性蛋白酶在液体洗涤剂中的溶解度的方法，所述方法包括，在由SEQIDNO:2所表示的氨基酸序列组成的碱性蛋白酶中，将选自SEQIDNo:2所表示的氨基酸序列的405位的氨基酸残基用亮氨酸或色氨酸取代。2.根据权利要求1所述的方法，其中将选自SEQIDNo:2所表示的氨基酸序列的表1-1的列(i)中所述的位置处的氨基酸残基的至少一个氨基酸残基用表1-1的列(ii)中所述的氨基酸残基取代：[表1-1]3.根据权利要求2所述的方法，其中所述至少一个氨基酸残基包括选自(B)81位、(C)40位、(D)191位和(E)59位的氨基酸残基的至少两个氨基酸残基。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述液体洗涤剂是包括40～90质量％的表面活性剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：东畑正敏，西村祐美，和田恭尚，佐伯胜久，奥田光美，
申请(专利权)人：花王株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP