荧光观察方法和荧光观察设备技术

本发明专利技术提供了一种荧光观察方法，其中可在不需要多种激发波长的情况下并且利用简单光学结构同时观察从多种荧光分子发射的多种荧光，荧光分子用作其荧光标签的被观察对象几乎不受损伤，并且可使用通常用作用于荧光观察的光学材料的玻璃，并且提供了一种荧光观察设备。根据本发明专利技术的用于检测从两种或更多种荧光分子发射的多种荧光的荧光观察方法包括以下步骤：利用可见区中的具有等于或小于700nm的激发激发波长的光使两种或更多种荧光分子的每种经受多光子激发，以在利用两种或更多种荧光分子的每种的深紫外区中的吸收波长带时产生荧光；以及同时检测在激发光的激发波长的较短波长侧或较短波长侧和较长波长侧二者上产生的多种荧光。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】荧光观察方法和荧光观察设备
本专利技术涉及观察从像例如多种荧光蛋白质这样的荧光分子发射的荧光的荧光观察方法，并且涉及荧光观察设备。
技术介绍
利用荧光分子观察生物分子是在医学或生命科学领域的标准观察方法。已开发了荧光波长不同的各种荧光分子，并且可以利用这些荧光分子彼此结合地观察多种生物分子。在观察由荧光分子发射的荧光的常规方法中，例如，存在：一种方法，其中利用可见区中的光通过单光子激发来激发荧光分子并且检测激发光的波长的较长波长侧产生的荧光(斯托克司频移)；以及一种方法，其中利用近红外区中的光通过多光子激发来激发荧光分子并且检测在激发光的波长的较短波长侧产生的荧光(参照例如非专利文献1)。在要观察多种荧光分子的情况下，这些荧光观察方法需要将要根据每种荧光分子的吸收光谱来选择激发光的最佳波长，因此具有以下问题：(问题1)在要同时观察多种荧光分子的情况下，为了利用波长彼此不同的多种激发光同时照射试样，需要用于多种激发光混合在同一路径中的的光学系统，以至于光学构造复杂；(问题2)当使用波长彼此不同的多种激发光来进行荧光观察时，将被收集在试样表面上的多种激发光由于当它们通过位于它们的路径上的光学系统时发生的色差而导致它们的焦点位置随着它们的波长变化，以至于破坏了空间重合性。结果，这个问题可导致在多种生物分子之间的交叠或生物分子的定位的分析中的伪像；以及(问题3)虽然在顺序地改变波长不同的多种激发光时针对每种荧光分子逐个执行荧光观察，但该过程不允许同时观察从各个荧光分子发射的荧光。具体地说，在观察诸如活细胞这样的活试样中在需要同时观察多种生物分子的运动的情况下产生不方便。另一方面，在作为能够解决上述问题1和问题2的现有技术文章的以下非专利文献2中公开了利用深紫外区中的光通过单光子激发激发荧光蛋白质的方法。非专利文献2公开了荧光分子(蛋白质)具有在深紫外区中的吸收波长带，并且尽管这些荧光分子彼此不同，但是这些荧光分子仍在深紫外区中具有公共吸收波长带。结果，如果用深紫外区中的光通过单光子激发来激发荧光分子并且检测激发光的波长的较长波长侧产生的荧光(斯托克司频移)，则能够同时观察到多种荧光。然而，在其中用深紫外区中的光通过单光子激发来激发荧光分子并且检测激发光的波长的较长波长侧产生的荧光(斯托克司频移)的情况下，具有以下问题：(问题4)为了将深紫外区中的光收集和引导到荧光分子上，则几乎没有可用的光学构件，并且在光学系统的构造中存在许多限制条件，因此，难以制造满足期望规格的光学系统。通常用作诸如光学窗和透镜这样的光学构件的玻璃在紫外线波长范围内显著地吸收系数增大并且透射率急剧地减小。结果，这种方法需要使用了诸如石英玻璃、氟化钙和氟化镁的特殊材料的特殊光学系统；以及(问题5)与可见光或红外光相比，深紫外区中的光具有较大的光能量，对活体造成大的光损伤。结果，在其中待观察的对象是像活细胞这样的活试样的情况下，深紫外区中的光不适于用作用于观察从试样上标记有的荧光分子发射的荧光的激发光。现有技术文献列表非专利文献非专利文献1Science-1990,vol.248,WinfriedDenketal.,“Two-PhotonLaserScanningFluorescenceMicroscopy”,Science,NewSeries,Vol.248,No.4951(April6,1990),pp.73-76非专利文献2Biochemistry.2004Nov30,43,14913-14923,Turoverovetal.,“ComparativestudiesonthestructureandstabilityoffluorescentproteinsEGFP,zFP506,mRFP1,“dimer2”andDsRed1”
技术实现思路
技术问题鉴于这些传统问题提出本专利技术。本专利技术的目的是提供荧光观察方法和荧光观察设备，其可在省去了多种激发波长的情况下利用简单的光学构造同时观察从多种荧光分子发射的多种荧光，并且对使用荧光分子作为其荧光标签的被观察对象几乎不造成损伤，并且允许利用普通玻璃作为用于荧光观察的光学材料。技术方案为了实现以上目的，根据本专利技术的一种用于检测从至少两种或更多种荧光分子发射的多种荧光的荧光观察方法，其特征在于该荧光观察方法包括以下步骤：通过激发可见区中的具有等于或小于700nm的激发波长的光使两种或更多种荧光分子的每种经受多光子激发，以在利用两种或更多种荧光分子的每种的深紫外区中的吸收波长带时产生荧光；以及同时检测在激发光的激发波长的较短波长侧或较短波长侧和较长波长侧二者上产生的多种荧光。另外，在本专利技术的荧光观察方法中，优选的是，用于荧光检测对象的两种或更多种荧光分子的每种具有在深紫外区和可见区中的吸收波长带。另外，在本专利技术的荧光观察方法中，优选的是，激发光是超短脉冲激光束。另外，在本专利技术的荧光观察方法中，优选的是，经由短通滤波器仅检测在激发波长的较短波长侧产生的荧光。另外，在本专利技术的荧光观察方法中，优选的是，检测在激发波长的短波长侧产生的具有400nm或更长的波长的荧光。另外，在本专利技术的荧光观察方法中，优选的是，以光谱选择方式来检测经由多光子激发产生的多种荧光。另外，在本专利技术的荧光观察方法中，优选的是，通过共焦检测来检测经由多光子激发而产生的多种荧光。另外，在本专利技术的荧光观察方法中，优选的是，同时检测经由多光子激发而产生的源于一个光子的荧光和源于两个光子的荧光。另外，一种根据本专利技术的荧光观察设备，其特征在于该荧光观察设备包括：光源，其以高密度发射具有预定波长的光；二次谐波产生元件，其使用来自该光源的光产生可见区中的具有700nm或更短的波长的二次谐波；以及显微镜，其被构造成利用由该二次谐波产生元件产生的光使多种荧光分子经受多光子激发，使得同时可观察在激发光的波长的较短波长侧或较短波长侧和较长波长侧二者上产生的多种荧光。另外，根据本专利技术的荧光观察设备，其特征在于，该荧光观察设备包括激发光产生单元，该激发光产生单元一体地设置有所述光源单元和所述二次谐波产生元件，以利用所述激发光产生单元产生的光对所述多种荧光分子进行多光子激发。另外，在本专利技术的荧光观察设备中，优选的是，二次谐波产生元件被构造成可插入源自光源的光路上并可从所述光路上移除。本专利技术的有益效果根据本专利技术，可获得荧光观察方法和荧光观察设备，其可在省去了多种激发波长的情况下利用简单光学构造同时观察从多种荧光分子发射的多种荧，并且对使用荧光分子作为荧光标签的被观察对象几乎不造成损伤，并且允许利用普通玻璃作为用于荧光观察的光学材料。附图说明图1是概念性地示出在现有技术中分别利用可见区中的光通过单光子激发、利用近红外区中的光通过双光子激发和利用深紫外区中的光通过单光子激发而由荧光分子产生的荧光光谱的曲线图。图2是示出多种荧光蛋白质的吸收光谱的曲线图。图3是示出图2所示的荧光蛋白质的激发光谱的曲线图。图4是概念性地示出根据本专利技术的荧光观察方法在利用可见区中的光的多光子激发中由一个荧光分子产生的荧光光谱的曲线图。图5是分别示出以下情况中的能态的说明图：在现有技术中，利用可见区中的光的单光子激发和利用深紫外区中的光的单光子激发；以及根据本专利技术的荧光观察方法的利用可见区中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测从两种或更多种荧光分子发射的多种荧光的荧光检测方法，其特征在于，该荧光观察方法包括以下步骤：通过可见区中的具有等于或小于700nm的激发波长的激发光对两种或更多种荧光分子的每种进行多光子激发，以利用所述两种或更多种荧光分子的每种的深紫外区中的吸收波长带产生荧光；以及同时检测在激发光的激发波长的短波长侧、或短波长侧和长波长侧二者上产生的多种荧光。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.03.26 JP 2012-0686861.一种用于检测从两种或更多种荧光分子发射的多种荧光的荧光检测方法，其特征在于，该荧光观察方法包括以下步骤：通过可见区中的具有等于或小于525nm的激发波长的激发光对两种或更多种荧光分子的每种进行多光子激发，以利用所述两种或更多种荧光分子的每种的深紫外区中的吸收波长带将所述两种或更多种荧光分子的每种多光子激发为第2激发态以上来产生荧光；以及同时检测在激发光的激发波长的短波长侧、或短波长侧和长波长侧二者上产生的多种荧光。2.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，用于荧光检测对象的所述两种或更多种荧光分子的每种具有深紫外区和可见区中的吸收波长带。3.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，所述激发光是超短脉冲激光束。4.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，利用短通滤波器仅检测在所述激发波长的短波长侧产生的荧光。5.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，检测在所述激发波长的短波长侧产生的具有400nm或更长的波长的荧光。6.根据权利要求1所述的荧光检测方法，其特征在于，以光谱选择的方式检测通...

【专利技术属性】
技术研发人员：藤田克昌，永井健治，齐藤健太，山中真仁，泷本真一，
申请(专利权)人：奥林巴斯株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP