具有蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及具有蛋白酶活性的分离多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明专利技术还涉及核酸构建体、载体以及包含这些多核苷酸的宿主细胞连同生产和使用这些多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及具有蛋白酶活性的分离多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本专利技术还涉及核酸构建体、载体以及包含这些多核苷酸的宿主细胞连同生产和使用这些多肽的方法。【专利说明】具有蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸 参考一个序列表 本申请包含一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。 专利技术背景 专利
本专利技术涉及具有蛋白酶活性的分离多肽和编码这些蛋白酶的分离核酸序列。本发 明还涉及含有这些核酸序列的核酸构建体，载体和宿主细胞（包括植物和动物细胞），以及 制备和使用这些蛋白酶的方法，尤其这些蛋白酶在动物饲料和洗涤剂中的应用。 相关技术说明 本专利技术提供了具有蛋白酶活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。 洗涤剂工业已经在洗涤剂配制品中应用不同的酶超过30年，最常使用的酶包括 各自适应于去除各种类型污渍的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶。除了酶之外，洗涤剂组合物典型 地包括复杂的成分组合。例如，大部分清洁产品包括表面活性剂系统、漂白剂或助洗剂。鉴 于当前洗涤剂的复杂性，仍需要开发包含新酶和/或酶掺混物的新洗涤剂组合物。 传统上，在升高的温度进行洗涤并且选择熟知的洗涤剂在较高温度进行洗涤。 关注于改善洗涤过程以便使得它们更为环境友好地增加导致全球范围内倾向于 降低洗涤时间、pH和温度和减少可能负面地影响环境的洗涤剂组分的量。 因此存在着在较低温度洗涤的需求以及因此对于在低温具有高性能的洗涤剂蛋 白酶的需要。 在动物饲料中使用蛋白酶(体内)和/或使用这类的蛋白酶用于处理植物性蛋白质 (体外）中，注意的是蛋白质对于动物和人类是必需营养因子。大部分家畜和许多人从植物 性蛋白质来源获得这些必需蛋白质。重要的植物性蛋白质来源是例如油籽作物、豆类和谷 类。 当例如大豆饼粉包含在单胃动物如猪和家禽的饲料中时，相当大比例的大豆饼粉 固体未被有效地消化(在小猪、生长猪和家禽如肉仔鸡、蛋鸡和公鸡中的表观回肠蛋白消化 率仅是80%左右)。 动物的胃肠道是由一系列各自呈现不同pH环境的段组成。在单胃动物如猪和家 禽以及许多鱼中，胃展现了低至PH1-2的强酸性pH，而肠展现了在pH6-7范围内的一个更中 性的pH。除了胃和肠之外在胃之前家禽还具有一个嗉囊，该嗉囊中的pH主要取决于咽下的 饲料并因此典型地处于PH4-6的范围内。蛋白酶消化蛋白质可发生在整个消化道中，假如 该蛋白酶是有活性的并在该消化道的条件下存活。因此，以下这样的蛋白酶是特别令人希 望的的：它们是高度地酸稳定的以在胃环境中存活，并且同时在靶动物的宽的生理pH下是 有效地有活性的。 另外，动物饲料常常是以颗粒形式配制的，其中在该造粒过程采用蒸汽。因此以下 也是令人希望的，在动物饲料中使用的蛋白酶能在暴露于蒸汽处理之后保持活性。 在动物饲料中使用蛋白酶以改善饲料中的蛋白质的消化是已知的。W095/28850 披露了一种植酸酶与一种或多种微生物蛋白水解酶的组合以提高植物性蛋白质的溶 解度。WOO 1 /58 2 7 5披露了在动物饲料中使用枯草杆菌蛋白酶家族的酸稳定蛋白酶。 TOO 1/58276披露了与以下蛋白酶相关的酸稳定蛋白酶在动物饲料中的用途：衍生自拟诺 卡菌属NRRL18262 (10R蛋白酶）的蛋白酶，连同衍生自白拟诺卡氏菌DSM14010的蛋白酶。 W004/072221、TO04/111220、TO04/111223、TO05/035747、和 TO05/123911 披露了与 10R 蛋 白酶相关的蛋白酶和它们在动物饲料中的用途。另外，W004/072279披露了其他蛋白酶的 用途。 W004/034776披露了枯草杆菌蛋白酶/角蛋白酶、来自地衣芽孢杆菌的PWD-1在家 禽饲料中的用途。W004/077960披露了一种通过施用一种细菌或真菌蛋白酶增加草料或谷 物在反刍动物中的消化率的方法。 包括一种蛋白酶的并且上市用于在动物饲料中使用的商业产品包括 RONOZYME? ProAct (DSM NP/Novozymes)、AxtlB? (Danisco)、 Avi/yΠΙΟ --： (Danisco)> PoKzyme? (Danisco)> Allzyme? (Al 1 tech)、Vfersazyme? (BioResources、 Int.)、Poultrygrow? (Jefo)和C..'ihen/a...K: DP100 (Novus)。 专利技术概述 本专利技术涉及一种具有蛋白酶活性的分离多肽，该分离多肽选自由以下组成的组： (a) -种多肽，该多肽与SEQ ID N0:2的成熟多肽具有至少82%、至少83%、至少 84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少 93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性； (b) -种多肽，该多肽是由一种多核苷酸编码的，该多核苷酸与SEQ IDN0:1的成 熟多肽编码序列具有至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、 至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至 少98%、至少99%、或100%的序列一致性； (c)在一个或多个(例如若干个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQ ID N0:2 的成熟多肽的变体；以及 ⑷具有蛋白酶活性的（a)、（b)或（c)的多肽的一种片段。 本专利技术还涉及编码本专利技术的多肽的分离的多核苷酸；核酸构建体；重组表达载 体；包含这些多核苷酸的重组宿主细胞；及产生这些多肽的方法。 本专利技术还涉及本专利技术的这些蛋白酶在动物饲料和在洗涤剂中的用途，生产动物饲 料组合物和洗涤剂组合物的方法，并涉及动物饲料组合物和洗涤剂组合物。 本专利技术还涉及编码一种信号肽的一种多核苷酸，该信号肽包含SEQ ID N0:2的氨 基酸1至29或由其组成；编码一种前肽的一种多核苷酸，该前肽包含SEQ ID NO:2的氨基 酸30至188或由其组成；或编码一种信号肽和一种前肽的一种多核苷酸，该信号肽和前肽 包含SEQ ID N0:2的氨基酸1至188或由其组成，这些多核苷酸的每一种与编码蛋白质的 基因可操作地连接；涉及包含这些多核苷酸的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞；并 且涉及产生蛋白质的方法。 附图简要说明 图1显示来自澳大利亚糖丝菌的S1蛋白酶与10R蛋白酶相比对大豆-玉米粉的 活性。 定义 具有蛋白酶活性的多肽 具有蛋白酶活性的多肽，或蛋白酶，有时也被称为肽酶、蛋白水解酶、肽水解酶或 蛋白水解的酶。蛋白酶可以是始于任一端水解肽的外切型蛋白酶或在多肽链内部发挥作用 的内切型蛋白酶（内肽酶)。内肽酶对N-和C-末端被封闭的肽底物显示出活性，这些底物 与讨论的蛋白酶的特异性有关。 本文将术语"蛋白酶"定义为水解肽键的酶。蛋白酶的定义也适用于如此处使用 的术语"母体蛋白酶"和"蛋白酶变体"的蛋白酶部分。术语"蛋白酶"包括任何属于EC3. 4 酶组(包括其13个亚类中的每一个）的酶。该EC编号指的是Enzyme Nomenclature (酶命 名法）1992,来自NC-IUBMB本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有蛋白酶活性的分离多肽，该分离多肽选自由以下各项组成的组：(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性；(b)一种多肽，该多肽是由一种多核苷酸编码的，该多核苷酸与SEQ IDNO:1的成熟多肽编码序列具有至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性；(c)在一个或多个(例如几个)位置处包含取代、缺失、和/或插入的SEQID NO:2的成熟多肽的变体；以及(d)具有蛋白酶活性的(a)、(b)或(c)的多肽的一种片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：JW塔姆斯，T霍夫，M格杰曼森，PR奥斯特加德，RP奥林斯基，K庞托皮丹，C斯乔霍尔姆，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK