本发明专利技术属于电分析化学和DNA生物传感技术领域，涉及一种基于非生物蛋白酶——DNA酶生物传感器对2-羟基芴的检测。具体的以金电极为DNA酶载基，首先通过Au-S键作用将巯基修饰的DNA修饰到电极表面，并将该DNA修饰电极依次浸没到含K+、hemin溶液中形成具有类过氧化物酶催化活性的G-DNA酶。在双氧水介质中，通过电极表面G-DNA酶的催化作用引起膜电化学阻抗的增加，从而实现对2-羟基芴的检测。该电化学DNA生物传感器制备方法简单，价格低廉，检测周期短，响应时间快，稳定性好，选择性高且具有高灵敏等优点。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术属于电分析化学和DNA生物传感
，涉及一种基于非生物蛋白酶——DNA酶生物传感器对2-羟基芴的检测。具体的以金电极为DNA酶载基，首先通过Au-S键作用将巯基修饰的DNA修饰到电极表面，并将该DNA修饰电极依次浸没到含K+、hemin溶液中形成具有类过氧化物酶催化活性的G-DNA酶。在双氧水介质中，通过电极表面G-DNA酶的催化作用引起膜电化学阻抗的增加，从而实现对2-羟基芴的检测。该电化学DNA生物传感器制备方法简单，价格低廉，检测周期短，响应时间快，稳定性好，选择性高且具有高灵敏等优点。【专利说明】—种基于DNA生物传感器的2-羟基芴的测定方法
本专利技术属于电分析化学和DNA生物传感
，涉及一种采用非生物蛋白酶DNA酶修饰的电化学生物传感器对2-羟基芴的检测方法，此方法能快速实现对2-羟基芴的检测。
技术介绍
多环芳经(PolycyclicAromatic Hydrocarbons, PAHs)因其具有典型的“致癌”、“致畸”和“致突变”作用而引起人们的极大关注。羟基多环芳烃作为多环芳烃的衍生物，同样具有较强的生物毒性和环境危害性，而且一些羟基芳香烃类污染物已被列入优先监测黑名单中。一些羟基多环芳烃应用在许多工业领域，如煤气、焦化、炼油、冶金、机械制造、玻璃、石油化工、木材纤维、化学有机合成工业、塑料、医药、农药、油漆等，如直接排放则可污染大气、水、土壤和食品，因此预防羟基多环芳烃的污染工作任务艰巨，实现其在环境中的监测具有重要意义。到目前为止，用于羟基多环芳烃的分析检测的传统方法有很多种，如红外光谱法、双波长紫外分光光度法、直接荧光光度法、毛细管区带电泳法、共振光散射法、催化光度法、示差脉冲伏安法、固相微萃取-气相色谱法、高效液相色谱法、免疫检测法等，这些传统的检测方法存在仪器设备昂贵、需专业技术人员操作、操作费时、样本需要衍生处理和不能实现在线监测等缺陷，因此建立检测羟基多环芳烃的新方法有着重要的现实意义。 随着电化学技术和生物传感技术的发展，DNA生物传感器作为一种新型的检测技术越来越多的应用于检测环境污染物，但是到目前为止，应用DNA生物传感器对羟基多环芳烃的检测还比较少，如Yang等采用酸变性单链DNA修饰的玻碳电极实现了 1_萘酚的检测，这种基于鸟嘌呤氧化电流为信号的DNA生物传感器对1-萘酚具有较高的灵敏性；Liu等课题组采用hairpin DNA修饰的生物传感器对多种羟基多环芳烃进行了较为系统的研究，实现了对9-羟基芴的高灵敏检测并实现了水体中9-羟基芴的分析。值得指出的是，采用DNA生物传感器对羟基酚类物质的检测原理主要是基于DNA分子与羟基多环芳烃分子间的非特异性相互作用，因此这种电化学DNA生物传感器对酚类化合物不具有选择性，因此开发具有高选择性的DNA的生物传感器实现对羟基多环芳烃的检测具有十分重要的意义。 多环芳烃芴被列为优先控制的多环芳烃，研究发现，芴在体内酶活化的作用下可以发生代谢作用，其代谢的产物主要是2-羟基芴和9-羟基芴，也是一类具有较高生物活性和强毒性的致癌物质。此外，因二者是同分异构体在采用色谱法、光谱法进行分析时往往会互相产生干扰，且需对分析信号进行复杂的化学计量处理。到目前为止，应用电化学DNA传感器对2-羟基芴化合物的检测还未见报道。因此，开发对2-羟基芴灵敏性高、选择性强的DNA生物传感器具有很大的挑战性。 综上所述，建立、完善和发展2-羟基芴化合物的DNA生物分析方法是分析化学和环境化学的难点研究课题，既可为环境健康风险评价及职业安全评估提供参考，同时开发一种新的高灵敏、低成本的检测方法对完善现有检测技术手段亦具有重要意义和较好的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于DNA生物传感器的2-羟基芴的测定方法。 本专利技术的技术方案如下: 一种基于DNA生物传感器的2-羟基芴的测定方法，包括以下步骤: I)电极的处理: 将金电极在鹿皮抛光布上用膏状a-Al2O3抛光至镜面，抛光后洗去表面污物，并依次在乙醇和超纯水中超声清洗，重复三次；然后在H2SO4溶液中经循环伏安扫描至稳定，最后用超纯水冲洗干净，氮气吹干，得到表面干净的金电极； 2) DNA溶液的配制: 将固体DNA序列用Tris-NaClO4缓冲溶液溶解并稀释到一定浓度，用漩涡振荡器混匀，静置于室温下备用； 3) DNA修饰电极的制备: 将上述步骤I)活化处理的金电极浸泡在上述步骤2)配制的DNA溶液中，静置于室温下。巯基修饰的DNA通过Au-S键作用自组装于金电极表面，从而得到DNA修饰电极； 4)酶活性DNA修饰电极的制备: 将上述步骤3)制备的DNA修饰的金电极依次浸泡在Tris-NaClO4缓冲溶液配制的KC104、hemin溶液中各lh，从而得到具有类过氧化物酶催化活性的DNA修饰电极。 优选地，上述步骤2)中所述DNA浓度为2-20 μ Μ。 优选地，上述步骤4)中所述K+浓度为5_50mM。 优选地,上述步骤4)中所述hemin浓度为2-10 μ M。 本专利技术中，所使用的DNA序列是本领域人员所熟悉的，其获得可以通过供应商获得。 本专利技术的另一方面，涉及应用如上述制备方法得到的DNA修饰电极对2-羟基芴的检测方法，其具体检测方法为:以钼丝电极为对电极，银/氯化银(饱和KCl溶液)为参比电极，以DNA修饰的金电极为工作电极构筑三电极体系，先将DNA修饰电极在K3 /K4 溶液中进行电化学阻抗测量，测完后用Tris-NaClO4缓冲溶液淋洗，然后置于缓冲溶液配制的不同浓度的含过氧化氢的2-羟基芴溶液中，再进行电化学阻抗测定。 与现有技术相比本专利技术具有以下优点: 1.本专利技术所采用的DNA修饰电极，与传统的酶修饰电极相比具有成本较低、易于贮存的优势； 2.本专利技术所采用的DNA修饰电极是通过金-硫键作用将DNA自组装于金电极表面，与传统的酶修饰电极相比具有热稳定性高的优势； 3.本专利技术所采用的DNA修饰电极具有高催化活性、高专一性的优点； 4.本专利技术所制备的DNA修饰电极对2-羟基芴的检测具有灵敏性高、选择性强等特点。 【专利附图】【附图说明】 图1为金电极及DNA修饰的金电极的阻抗谱图； 图2为使用本专利技术的DNA修饰电极分别与K+、hemin、lmM2_羟基芴作用前后的尼奎斯特阻抗谱图=DNA膜(〇)，与K+作用(.)；与hemin作用(?);与2-羟基芴作用(■);其中，横坐标代表电化学阻抗的实部(电阻)，单位为Ω 纵坐标代表电化学阻抗的虚部(电容)，单位为Ω.cm2 ; 图3为DNA酶电极对2_羟基芴、9_羟基芴及缓冲体系中的的Λ Rct响应情况。 【具体实施方式】 以下实施实例对本专利技术做更详细的描述，但所述实施不构成对本专利技术的限制。 实施例1 I)将金电极在鹿皮抛光布上用0.05 μ m的a -Al2O3粉末抛光至镜面，抛光后先洗去表面污物，并依次在乙醇和去离子水中超声清洗，每次2?3min，重复三次；然后在Imol/L H2SO4溶液中经循环伏安扫描至稳定，最后用去离子水冲洗干净，氮气吹干，即可得到表面干净的金电极； 2)将本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于DNA生物传感器的2‑羟基芴的测定方法，其特征在于包括以下步骤：1)电极的处理：将金电极在鹿皮抛光布上用膏状α‑Al2O3抛光至镜面，抛光后洗去表面污物，并依次在乙醇和超纯水中超声清洗，重复三次；然后在H2SO4溶液中经循环伏安扫描至稳定，最后用超纯水冲洗干净，氮气吹干，得到表面干净的金电极；2)DNA溶液的配制：将固体DNA序列用Tris‑NaClO4缓冲溶液溶解并稀释到一定浓度，用漩涡振荡器混匀，静置于室温下备用；3)DNA修饰电极的制备：将上述步骤1)活化处理的金电极浸泡在上述步骤2)配制的DNA溶液中，静置于室温下。巯基修饰的DNA通过Au‑S键作用自组装于金电极表面，从而得到DNA修饰电极；4)酶活性DNA修饰电极的制备：将上述步骤3)制备的DNA修饰的金电极依次浸泡在Tris‑NaClO4缓冲溶液配制的KClO4、hemin溶液中各1h，从而得到具有类过氧化物酶催化活性的DNA修饰电极。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘新会，梁刚，于艳君，刘冠男，巩文雯，成登苗，
申请(专利权)人：北京师范大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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