烟草类胡萝卜素异构酶基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种烟草类胡萝卜素异构酶基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。在烟草中，本发明专利技术克隆了一个类胡萝卜素合成关键基因NtCRTISO，抑制该基因表达可以有效提高烟叶类胡萝卜素含量，并且提高烟株抵御光抑制的能力。本发明专利技术揭示了烟草中CRTISO基因在类胡萝卜素合成中的重要功能，对类胡萝卜素组成的调控起着至关重要的作用，寻找了一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，尤其是β-胡萝卜素，为植物分子改良提供了良好的理论指导。

【技术实现步骤摘要】
烟草类胡萝卜素异构酶基因及其应用
本专利技术属于植物基因工程领域，具体地，本专利技术涉及烟草类胡萝卜素合成关键基因异构酶基因NtCRTISO及其应用。特别是涉及类胡萝卜素异构酶(CRTISO)在类胡萝卜素合成及植物生长发育中的重要作用。
技术介绍
类胡萝卜素合成途径在高等植物中扮演重要角色。该途径的中间代谢产物，如β-胡萝卜素、黄体素等参与植物的光合作用；终产物包括脱落酸、独脚金内酯等，与植物抗氧化和生长发育相关。烟草中的类胡萝卜素属于萜烯类化合物，其含量的高低能够影响烟叶的外观和内在品质，它不仅与调制后烟叶的颜色有关，而且其降解和热裂解产物包含近百种香气物质，与烟叶的香气有密切关系。Weeks研究发现，在烟叶质量提高的同时，类胡萝卜素降解物含量明显增加。对β-胡萝卜素降解产物进行了加香实验，结果表明添加β-胡萝卜素的降解产物能够丰满烟气，增浓烟香。烟草作为一种重要的模式植物，也为该通路研究提供了良好的材料。1993年，Misawa等人将细菌八氢番茄红素脱氢酶基因(crtI)转入烟草，使其过量表达，结果转基因烟草中β-胡萝卜素的累积量明显提高。2000年，Mann等人将烟草中β-胡萝卜素酮酶基因(crt0)过表达，使虾青素等酮基类胡萝卜素在烟草中不断累积，最终使花蜜腺的颜色由黄变红。CRTISO基因是植物中类胡萝卜素合成的关键基因之一，它催化多反式番茄红素形成多顺式番茄红素，该基因表达量降低能够导致β-胡萝卜素大量积累。然而烟草中关于该基因的研究甚少，因此只能从其它植物的CRTISO基因的研究中获取一些有价值的信息。Kato等人发现柑橘中CRTISO基因下调能够使果实中β-胡萝卜素含量提高，证实了该基因与β-胡萝卜素的合成代谢相关。陶能国等人克隆了纽荷尔脐橙的CRTISO基因，该基因与拟南芥、番茄和柑橘的CRTISO基因高度相似，可以推测纽荷尔脐橙的CRTISO基因也与β-胡萝卜素的合成累计有密切关系。本专利技术从普通烟草中克隆CRTISO基因，并对该基因的表达和功能进行研究，旨在揭示该基因在烟草类胡萝卜素合成通路中的作用，试图寻找一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，尤其是β-胡萝卜素，为选育高含量类胡萝卜素的烟草提供技术支持。
技术实现思路
本专利技术根据番茄和马铃薯的前番茄红素异构酶基因序列通过同源克隆的方式，从栽培烟草红花大金元体内克隆获得CRTISO基因序列，对其进行了表达模式分析。利用烟草脆裂病毒(tobaccorattlevirus,TRV)诱导基因沉默注射本氏烟草，结果表明CRTISO的表达抑制可以提高烟叶类胡萝卜素含量，并且提高了烟株的光合作用能力。该研究结果能够为利用基因工程技术培育优良品种提供理论依据和基因资源。本专利技术的技术方案是：一种烟草类胡萝卜素异构酶基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。所述的烟草类胡萝卜素异构酶基因的应用，所述烟草类胡萝卜素异构酶基因提高烟草类胡萝卜素含量。一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，通过瞬时表达技术干扰、沉默烟草类胡萝卜素异构酶基因，获得类胡萝卜素含量提高的烟草转化植株。所述的提高烟草类胡萝卜素含量的方法，以所述烟草类胡萝卜素基因的特异性核苷酸片段作为引导序列，将特异性核酸片段以正反两个方向插入到植物表达载体中，构建所述烟草类胡萝卜素基因的病毒诱导基因沉默载体和RNAi载体。首先，从普通烟草cDNA中扩增出NtCRTISO编码序列，研究其在烟草不同时期不同器官中的转录水平表达模式，发现该基因主要在烟草叶中表达。利用TRV介导的基因沉默技术研究该基因表达受到抑制后，烟草类胡萝卜素合成通路基因表达和类胡萝卜素含量变化及光合生理指标的变化。在烟草中，我们克隆了一个类胡萝卜素合成关键基因NtCRTISO，抑制该基因表达可以有效提高烟叶类胡萝卜素含量，并且提高烟株抵御光抑制的能力。本专利技术揭示了烟草中CRTISO基因在类胡萝卜素合成中的重要功能，对类胡萝卜素组成的调控起着至关重要的作用，寻找了一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，尤其是β-胡萝卜素，为植物分子改良提供了良好的理论指导。附图说明图1为四倍体栽培烟草不同时期、(stage1-stage4分别为团棵期、旺长期、现蕾期、盛花期)的各类器官(根-R、茎-S、叶-L(5叶位-5L，10叶位-10L，15叶位-15L)、花-F，)中NtCRTISO的转录表达模式；图2氏烟中CRTISO基因的表达抑制表型。Control：接种生理盐水对照烟草；TRV：接种TRV空载体对照烟草；TRV-CRTISO：接种携带CRTISO基因片段病毒的烟草；图3烟草中定量PCR检测病毒介导的CRTISO基因沉默效果。Control：接种生理盐水对照样；TRV：接种TRV空载体对照样；TRV-CRTISO：接种携带CRTISO基因片段病毒样；图4烟草中HPLC检测病毒介导的CRTISO基因沉默后烟草植株类萝卜素(β-胡萝卜素、紫黄质、新黄质和黄体素)含量及叶绿素a和b的含量。Control：接种生理盐水对照样；TRV：接种TRV空载体对照样；TRV-CRTISO：接种携带CRTISO基因片段病毒样；图5A为烟草中病毒介导的CRTISO基因沉默后叶片在低温弱光胁迫条件下Fv/Fm的变化，Fv/Fm是指植物叶片光合系统II的最大光化学效率；B为病毒介导的CRTISO基因沉默后叶片在低温弱光胁迫条件下NPQ的变化(非光化学耗散)。具体实施方式一种烟草类胡萝卜素异构酶基因，其碱基序列如SEQIDNO：1所示。所述的烟草类胡萝卜素异构酶基因的应用，所述烟草类胡萝卜素异构酶基因提高烟草类胡萝卜素含量。一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，通过瞬时表达技术干扰、沉默烟草类胡萝卜素异构酶基因，获得类胡萝卜素含量提高的烟草转化植株。所述的提高烟草类胡萝卜素含量的方法，以所述烟草类胡萝卜素基因的特异性核苷酸片段作为引导序列，将特异性核酸片段以正反两个方向插入到植物表达载体中，构建所述烟草类胡萝卜素基因的病毒诱导基因沉默载体和RNAi载体。1、NtCRTISO基因的同源克隆以及表达模式分析根据番茄和马铃薯的前番茄红素异构酶基因序列通过同源克隆的方式，从栽培烟草红花大金元cDNA中PCR扩增CRTISO基因序列，回收目的片段，T-A连接，转化大肠杆菌(DH5α)感受态，37℃培养，菌落PCR鉴定得到阳性克隆。阳性质粒提取，最后进行质粒酶切鉴定和测序得到普通烟草NtCRTISO编码区全长序列。获得的NtCRTISO编码区(CDS)全长序列1716bp，共编码571个氨基酸。该基因序列已经上传至NCBI，Genbank：KJ909512。并且对该基因在普通烟草体内的时空表达模式进行了分析。采集栽培烟草的各个时期(团棵期、旺长期、现蕾期、盛花期)的各类器官(根、茎、叶(5叶位，10叶位，15叶位)、花，)样品，并提取它们的总RNA，反转录成为cDNA。定量PCR((BIO-RAD,USA))分析NtCRTISO时空表达模式。如附图1中所示，NtCRTISO在叶中稳定表达，在现蕾期表达量较高，且多表达在中部叶中(表达水平：10叶位＞15叶位＞5叶位＞花≥茎＞根)。具体步骤如下所述：所用引物为CRTISO-F：5’-ATGGCGTTGAGGTTTCAACCTTTTTC-3’和C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种烟草类胡萝卜素异构酶基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种提高烟草类胡萝卜素含量并增强植物抵御低温弱光抑制能力的烟草类胡萝卜素异构酶基因的应用，其特征在于：所述烟草类胡萝卜素异构酶基因提高烟草类胡萝卜素含量，并增强植物抵御低温弱光抑制能力；其碱基序列如SEQIDNO：1所示。2.一种提高烟草类胡萝卜素含量的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：王燃，史艳梅，魏攀，武明珠，陈千思，罗朝鹏，李锋，金立锋，魏春阳，林福呈，屈凌波，杨军，范楷，陈霞，郑庆霞，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，
类型：发明
国别省市：河南;41