一种通过胚抢救获得柑橘杂交后代的方法技术

一种通过胚抢救获得柑橘杂交后代的方法，通过提取抗病性强的植株花粉，对母本植株进行杂交授粉，获得杂交果实后，将合子胚、珠心胚分离开，保留合子胚，并对合子胚采用人工培养基培养，避免了合子胚的败育，具有抗溃疡病有性后代植株，具有操作性强、简单实用、效果显著等优点。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】，通过提取抗病性强的植株花粉，对母本植株进行杂交授粉，获得杂交果实后，将合子胚、珠心胚分离开，保留合子胚，并对合子胚采用人工培养基培养，避免了合子胚的败育，具有抗溃疡病有性后代植株，具有操作性强、简单实用、效果显著等优点。【专利说明】【
】本专利技术涉及一种获得柑橘杂交后代的方法，具体涉及。【
技术介绍
】柑橘在目前已成为世界上第一大水果，每年总产已超过I亿吨，占世界水果总产的25%左右，是世界第三大贸易农产品。全球有100多个国家和地区生产柑橘。我国是柑橘的原产中心之一，也是柑橘的生产大国，种植面积及产量均居世界第一。柑橘溃疡病(citrus bacterial cankerdisease, CBO))是一种世界性病害，是国际、国内植物检疫对象，该病起源于亚洲，分布于世界多个国家和地区，又称为亚洲病害。近年来，各地区该病害发生有加重趋势，给柑橘产业带来了巨大损失。由于不同柑橘种类和品种对溃疡病的抗性差异大，枸橼的果实果肉硬，酸涩苦，口感粗糙，商品性差但抗病；而冰糖橙少子，香甜多汁，商品性好但易感病。从柑橘溃疡病抗性遗传上讲，用抗病品种作母本的杂交后代，多数表现为抗病或介于双亲之间，用感病品种作母本的杂交后代几乎都表现为感病。因此，通过常规杂交育种的方式，以枸橼为父本，冰糖橙为母本，期望得到对柑橘溃疡病有抗性且商品性良好的杂交后代。然而柑橘有多胚现象，即在种子发育过程中或成熟种子中出现两个或两个以上的胚，这些胚中除一个是由受精卵发育的合子胚，其余都是由珠心细胞发育来的珠心胚。珠心胚的旺盛生长，往往在合子胚的发育过程中侵入胚囊，阻碍合子胚的发育，使合子胚在发育的早期阶段就败育或退化，由于柑橘种子多胚性和育种周期长，柑橘杂交育种一直较难取得成功。【
技术实现思路
】本专利技术针对上述问题，提供，通过将杂交授粉后果实种子中合子胚、珠心胚分离开，之后对合子胚进行培养以获得具有抗溃疡病的柑橘杂交后代。本专利技术提供的，其包括以下步骤:SOl:杂交授粉:提取父本花粉；对母本花朵进行去雄处理后，授以父本花粉；将授粉后的母本花朵进行套袋密封处理；8?12天之后去掉密封袋，喷保花保果剂；S02:提取合子胚:母本花朵进行杂交授粉90?110天后，采收幼果待用；将采收的幼果进行消毒处理后，取出果实种子；之后将拨开果实种子果皮，将果实种子内的合子胚、珠心胚分离开，去掉珠心胚，保留合子胚；S03:合子胚培养、获得胚培苗:将获取的合子胚放入Murashge and Tucker (以下简称MT)+GA3(赤霉素)lmg/L培养基后，放入密封的培养器中，在温度为26°C?28°C、湿度为75%?85%的无光条件下培养5?7天，待合子胚生出根后在有光条件下继续培养，25?35天之后将合子胚转入MT+GA3(赤霉素)lmg/L+3%蔗糖培养基中进行培养获得胚培苗；S04:炼苗、移栽:待胚培苗长出至少3片真叶后，将密封的培养器打开进行炼苗，7?15天后，清洗掉胚培苗根部残留的培养基，移栽至装有基质的营养钵中。特别的，所述步骤SOl采用人工点授法，首先将获取的I份父本花粉与5?8份滑石粉混合均匀获得稀释花粉，将获得的稀释花粉装入瓶中，之后采用一端具有弹性部件的杆状件沾取稀释花粉，每沾取一次点授3?5多母本花朵。特别的，所述步骤S02中对幼果消毒时首先将幼果果实表面用75%酒精进行第一次消毒，之后将幼果放于酒精灯上灼烧进行第二次消毒，直至果实表皮变黑。特别的，所述步骤S03中对于在无光环境下未生根的合子胚，将其转入MT+IBA0.5mg/L的培养基中进行诱导生根，生根后转入MT+GA3(赤霉素)lmg/L+3%蔗糖培养基中进行培养获得胚培苗。特别的，所述步骤S04中，所述基质为MT+GA3lmg/L+3%蔗糖培养基。相较于现有技术，本专利技术通过将合子胚、珠心胚分离开后，避免了合子胚的败育，采用人工培养基对合子胚进行培养，可在短期内获得大量具有抗溃疡病有性后代植株，具有操作性强、简单实用、效果显著等优点。【【具体实施方式】】为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实验对本专利技术进一步详细说明。实验中采用母本:冰糖橙(CitrussinensisOsbeck),父本:枸橼(Citrusmedica),定植于国家柑橘种质资源圃。本专利技术所提供的，具体包括以下步骤:S01:杂交授粉:1.采集枸橼花瓣未开放的花朵，用镊子摘取掉花瓣，将花药摘下放置于垫有纸张的培养皿上，之后将培养皿放置于温度为22?25°C的环境下，I?2天后花药裂开散粉，将花粉用筛子筛去杂物后，将获得的枸橼花粉装在暗色瓶内，密封后放于冰箱内备用；2.将获取的I份父本花粉与5?8份滑石粉混合均匀获得稀释花粉，将获得的稀释花粉装入瓶中，在冰糖橙花药成熟但花朵未开放时，用镊子将花瓣去除，再将花药或将花丝去掉，之后采用一端具有弹性部件的杆状件沾取稀释花粉，在冰糖橙花朵柱头上轻轻一抹，每沾取一次点授3?5多冰糖橙花朵，采用此方法可以使父本花粉送粉到柱头，进一步使坐果准确可靠，果实发育整齐；此次对4500朵花进行人工授粉，采收时，结果424个，采用本专利技术所提供的授粉方式坐果率为9.42%，一般柑橘坐果率为2.5%?5%，可见采次授粉坐果率较高；3.用羊皮纸做成防雨小袋，将授粉后的冰糖橙柱头套袋，之后用回形针封住袋口，授粉8?12天之后去掉防雨小袋，喷保花保果剂。S02:提取合子胚:1.冰糖橘花朵于授粉90?110天后，采摘100个果实，此时果实种子中的种子没有发育成熟，合子胚尚未败育；2.将采收的幼果放在消过毒的工作台上，之后将果实表面用75%酒精进行第一次消毒，然后将幼果放于酒精灯火焰上直至果实表皮变黑，此时消毒完成，然后用消过毒的手术刀沿幼果果实赤道面将果实切开成两半，注意不碰伤种子，此次共取得269粒果实种子;3.将获取的果实放于显微镜下，采用消过毒的手术刀将种子剥开部分种皮，之后采用消过毒的镊子和手术刀将每粒种子的合子胚、珠心胚逐一分离开，共获得1644个合子胚。S03:合子胚培养、获得胚培苗:整个合子胚培育过程温度保持在26V?28°C、湿度保持在75%?85%。将获取的合子胚放入MT+GA3 (赤霉素)lmg/L的培养基后,放入密封的培养器中，在无光条件下培养5?7天，待合子胚生出根后在有光条件下继续培养，25?35天之后将合子胚转入MT+GA3(赤霉素)lmg/L+3%蔗糖的培养基中进行培养获得胚培苗；对于在无光环境下未生根的合子胚，继续培养观察5?7天，生根后在有光条件下继续培养，25?35天之后将合子胚转入MT+GA3(赤霉素)lmg/L+3%蔗糖的培养基中进行培养获得胚培苗；对于仍未生根的合子胚将其将其转入MT+IBA0.5mg/L的培养基中进行诱导生根，生根后转入MT+GA3lmg/L+3%蔗糖的培养基中进行培养获得胚培苗；将就不生根的合子胚转入MT+IBA0.5mg/L培养基中，能较好的促进生根。S04:炼苗、移栽:待胚培苗长出至少3片真叶后，将密封的培养器打开进行炼苗，使胚培苗生长环境温度、湿度与外界环境一致，7?15天后，清洗掉胚培苗根部残留的培养基，移栽至装有新鲜MT+GA3lmg/L+3%蔗糖培养基的营养钵中。炼苗后移栽至营养钵中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过胚抢救获得柑橘杂交后代的方法，其特征在于，包括以下步骤：S01：杂交授粉：提取父本花粉；对母本花朵进行去雄处理后，授以父本花粉；将授粉后的母本花朵进行套袋密封处理，8～12天之后去掉密封袋，喷保花保果剂；S02：提取合子胚：母本花朵进行杂交授粉90～110天后，采收幼果待用；将采收的幼果进行消毒处理后，取出果实种子；之后将拨开果实种子果皮，将果实种子内的合子胚、珠心胚分离开，去掉珠心胚，保留合子胚；S03：合子胚培养、获得胚培苗：将获取的合子胚放入MT+GA31mg/L培养基后，放入密封的培养器中，在温度为26℃～28℃、湿度为75％～85％的无光条件下培养5～7天，待合子胚生出根后在有光条件下继续培养，25～35天之后将合子胚转入MT+GA31mg/L+3％蔗糖培养基中进行培养获得胚培苗；S04：炼苗、移栽：待胚培苗长出至少3片真叶后，将密封的培养器打开进行炼苗，7～15天后，清洗掉胚培苗根部残留的培养基，移栽至装有基质的营养钵中。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈仕贵，陈扬，朱丽娜，张子烨，崔勇，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43