一种疫霉多糖激发子Gep1及其在提高植物抗病性中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种疫霉多糖激发子Gep1及其在提高植物抗病性中的应用，Gep1多糖激发子分离纯化自烟草疫霉，经薄层层析分析，确定该多糖的单糖组成为葡萄糖，Gep1具热稳定性，可耐受酸碱，在100℃高温处理60min后和pH2-12条件下仍具有活性，将其喷洒在植物叶面，可以诱导烟草产生抗性，对烟草花叶病毒病有较好防效。每升疫霉发酵液可分离获得6g多糖激发子，产量远高于蛋白质激发子。多糖激发子施用在田间后，在植物体内、土壤和水体中易分解，无残留，对环境无污染，对人畜等非靶标生物相对安全，不易产生抗药性。因此，该产品将具有十分广阔的应用与市场前景。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种疫霉多糖激发子Gep1及其在提高植物抗病性中的应用，Gep1多糖激发子分离纯化自烟草疫霉，经薄层层析分析，确定该多糖的单糖组成为葡萄糖，Gep1具热稳定性，可耐受酸碱，在100℃高温处理60min后和pH2-12条件下仍具有活性，将其喷洒在植物叶面，可以诱导烟草产生抗性，对烟草花叶病毒病有较好防效。每升疫霉发酵液可分离获得6g多糖激发子，产量远高于蛋白质激发子。多糖激发子施用在田间后，在植物体内、土壤和水体中易分解，无残留，对环境无污染，对人畜等非靶标生物相对安全，不易产生抗药性。因此，该产品将具有十分广阔的应用与市场前景。【专利说明】一种疫霉多糖激发子Gepl及其在提高植物抗病性中的应用
本专利技术属于农业微生物学技术及生物化学与分子生物学
，具体涉及一种疫霉多糖激发子Gepl，还涉及其在提高植物抗病性中应用。
技术介绍
糖类激发子是指具有激活植物自身免疫、提高植物抗病抗逆能力的糖类物质，属于生物源激发子(Yin H et al.2010)。糖类一直被认为是一类惰性化合物，只作为生物体内的代谢能量来源或充当结构保护材料(如植物细胞壁)。Ayers等在1976年发现细胞壁的寡糖碎片可以诱导大豆产生植保素(phytoalexin),从此人们对糖类功能开始了新的认识。目前，人们已普遍认为寡糖是能够诱导高等植物防御反应的激发子中的一类。它们实现功能的基本原理是通过激发植物产生病程相关蛋白(pathogenesis-related protein,PR蛋白)和植保素等，增强植物的抗病性。 目前已鉴定的真菌激发子大多数是低聚糖或糖蛋白，少数为蛋白质或多肽。β -1, 3-β -1, 6-葡寡糖是最具代表性的真菌激发子，它是从大豆致病菌大雄疫霉菌(Phytophthora megasperma)的细胞壁水解产物中得到的。当浓度为lCT3-lCT4mol/L时，即可诱导大豆叶片产生植保素(Sharp et al.1984)。Smith(1991)从爺病镰刀菌(Fusariumsolani)中分离得到一种可诱导紫花苜蓿产生豌豆素的脱乙酰壳多糖。许多研究证明，壳多糖能够有效诱导多种植物产生抗病性，对病害的防治有明显效果，如可诱导番茄对根腐菌和早疫霉抗性，还可诱导大豆幼苗抗大豆镰刀菌根腐病(F.0xysporum) (Smith etal.1991)。 葡聚(寡)糖与其他糖类激发子的不同之处是其通常包括主链与侧链，具有β-1，3和β _1，6两种连接方式。β-D-葡聚糖(β-D-glucan)广泛存在于真菌、褐藻、地衣及谷物等生物体中，具有诱导植物产生抗病性，抗细菌、抗病毒、抗肿瘤和促愈合等生物活性。其降解产物β-葡寡糖能诱导大豆、甜椒、紫花苜蓿、水稻、拟南芥、烟草、小麦和葡萄等多种植物产生抗性，其作用机制可简单概括如下:首先被植物细胞壁或细胞膜上的受体识别后转入胞内，进而引起胞内钙离子(Ca2+)流、质膜去极化、胞外碱化等一系列早期信号反应，再经过一氧化氮(nitric oxide,NO)、活性氧(reactive oxgen species,R0S)等二级信号分子的进一步转导和放大，包括水杨酸(salicylic acid, SA)、茉莉酸(jasmonic acid,JA)、乙烯(ethylene，ET)等植物激素的积累和释放来调控防卫基因的表达，从而积累PR蛋白和次级代谢产物，来诱导植物自身免疫抗性，抵抗病原物质的侵染(武维华2003)。 研究发现β -葡寡糖激发子的结构不同对植物的诱导作用不同。大豆和蝶形花科植物可以识别具分支结构的β-1，3-β-1，6葡七糖(以β-1，6-为主链，带有β_1，3侧链)，却不能识别线性的β -1, 6-葡寡糖。烟草和番茄能够识别线性β -1, 3-葡寡糖，而欧芹却不能识别。线性的β_1，6-葡寡糖无法诱导水稻产生抗病性，而含一个1，6分支的线性β-1，3-葡五糖却能诱导水稻产生植保素(Yamaguchi et al.2000)。 糖化学家采用不同结构的葡寡糖，通过测定激发子的活性及其与细胞膜的结合能力来研究葡寡糖的不同结构对诱导植物抗性能力差异的影响。结果表明，移除葡寡糖非还原端的葡萄糖残基或改变支链结构会显著降低植物的抗病活性；而增加葡寡糖还原端的葡萄糖残基、或对其进行烷基及其他基团修饰，其活性基本不变。例如，去掉非还原端的3个葡萄糖残基或支链葡萄糖残基的葡七糖不能或几乎不能诱导大豆产生和积累植保素(Yi et al.2003) ?此外，葡寡糖经硫酸化后可提高诱导植物抗病的效果(Menard etal.2004)。研究人员还发现，若要诱导酸性和碱性PR蛋白的表达，则硫酸化修饰的程度要大于0.4(DS>0.4)，且DS>1.5时，诱导效果更加明显。例如对于烟草，DS = 2.4的海带淀粉(β -1, 3葡寡糖)(Iaminaran)可以诱导PR蛋白的表达，抵抗烟草花叶病毒的侵染。 烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)是最重要的植物病毒之一,可侵染36科350多种植物，其中最主要的是茄科植物，以烟草和番茄尤重(商鸿生和李振岐2005)。感染TMV的植株的典型症状是花叶，发病初期新叶上发生“脉明”现象，并逐渐从叶片的基部向顶端发展，最后扩展至整个叶片。受病毒的干扰，叶片厚薄不均，形成疱斑、皱缩，甚至扭曲。严重时叶片呈柳叶状。早期发病植株生长缓慢，不能开花结果，即使结果其种子也不能发芽或发芽率极低(Reinero and Beaehy 1986)。 寡聚糖不仅能够调控植物生长，还能够诱导植物产生抗性相关的活性物质，抑制病害的形成。目前，尚未见从疫霉真菌中分离葡聚糖激发子的报道。我们从烟草疫霉(Phytophthora parasitica)的培养滤液中分离纯化出一种葡聚糖类激发子,发现该激发子能诱导烟草对TMV的系统抗性，其对TMV的防治效果优于市售超敏蛋白。研究结果丰富了葡聚(寡)糖与病原菌互作的理论，同时也为日后开发应用新的生防农药提供了一定的理论支撑。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种疫霉多糖激发子，该多糖激发子分离纯化自烟草疫霉，经薄层层析分析，确定该多糖的单糖组成为葡萄糖， 申请人:将其命名为Gepl。 本专利技术的另一个目的在于提供了一种疫霉多糖激发子Gepl在提高植物抗病性中的应用。将其喷洒在植物叶面，它可以诱导烟草产生抗性，对烟草花叶病毒病有较好防效。 为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施: 一种疫霉多糖激发子Gepl，通过以下步骤制备得到: 1.将烟草疫霉(P.parasitica)的发酵液先用4层纱布过滤，再离心后收集上清液。氯仿、胰蛋白酶和蛋白酶K除去蛋白。再加入4X体积的无水乙醇放置于_20°C沉淀过夜，离心弃上清，沉淀经真空冷冻干燥得到的粉末即为粗多糖。 2.活性物质的分离纯化及有效成分鉴定:将上述获得的粗多糖溶于少量的蒸馏水中，依次通过DEAE-52纤维素柱层析和Sephadex G-100柱层析进一步分离纯化,硫酸-苯酚法检测糖含量绘制洗脱曲线。利用洗脱曲线各峰值的组分进行活性检测。在活性分析后，对有活本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种疫霉多糖激发子Gep1，通过以下步骤制备得到：1）将烟草疫霉（P. parasitica）的发酵液先用纱布过滤，再离心后收集上清液；氯仿、胰蛋白酶和蛋白酶K除去蛋白，再加入4 × 体积的无水乙醇放置于‑20 ℃沉淀过夜，离心弃上清，沉淀经真空冷冻干燥得到的粉末即为粗多糖；2）将上述获得的粗多糖溶于少量的蒸馏水中，依次通过DEAE‑52 纤维素柱层析和Sephadex G‑100柱层析进一步分离纯化，硫酸‑苯酚法检测糖含量绘制洗脱曲线；利用洗脱曲线各峰值的组分进行活性检测；在活性分析后，对有活性的物质进行真空冷冻干燥进行浓缩，即得疫霉多糖激发子Gep1。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵秀云，祁高富，霍瑞，李锡宏，许汝冰，王瑞，谭军，郭利，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42