利用组织培养法生产苹果类黄酮制造技术

本发明专利技术公开了利用组织培养法生产苹果类黄酮。本发明专利技术提供了一种利用组织培养法制备类黄酮的方法，包括如下步骤：1)将R6R6基因型植株外植体在愈伤组织诱导培养基中诱导培养，得到愈伤组织；2)将所述愈伤组织在继代培养基中继代培养，得到继代愈伤组织；3)将所述继代愈伤组织在增强培养基中增强培养，得到增强后愈伤组织；4)提取所述增强后愈伤组织中的类黄酮，得到目的产物。本发明专利技术的实验证明，利用上述方法培养的愈伤组织，其类黄酮含量是‘金帅’等苹果品种果肉类黄酮含量的30倍以上，可以实现利用组织培养法进行苹果类黄酮的工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了利用组织培养法生产苹果类黄酮。本专利技术提供了一种利用组织培养法制备类黄酮的方法，包括如下步骤：1)将R6R6基因型植株外植体在愈伤组织诱导培养基中诱导培养，得到愈伤组织；2)将所述愈伤组织在继代培养基中继代培养，得到继代愈伤组织；3)将所述继代愈伤组织在增强培养基中增强培养，得到增强后愈伤组织；4)提取所述增强后愈伤组织中的类黄酮，得到目的产物。本专利技术的实验证明，利用上述方法培养的愈伤组织，其类黄酮含量是‘金帅’等苹果品种果肉类黄酮含量的30倍以上，可以实现利用组织培养法进行苹果类黄酮的工业化生产。【专利说明】利用组织培养法生产苹果类黄酮
本专利技术涉及生物
，尤其涉及植物生物
，具体涉及利用组织培养 法生产苹果类黄酮。
技术介绍
"医食同源"是发展方向。类黄酮是苹果果实中的一类主要多酚类物质，对人体健 康具有多方面的生理功能；而苹果是世界性果品，由于其生态适应性强、果品营养价值高、 耐贮性好及供应周期长，世界上相当多的国家都将其列为主要消费果品而大力推荐；我国 是世界上最大的苹果生产和消费国，其中2012年生产苹果3950万吨，主要用于鲜食，且近 70%是类黄酮含量较低的'红富士'品种。因此，为保证消费者从苹果中摄取足够的多酚和 类黄酮，有效利用我国新疆野苹果资源，进一步培育并推广类黄酮含量高的功能型苹果新 品种，研究建立利用愈伤组织生产苹果类黄酮的离体组织培养技术体系，对于新疆野苹果 资源的科学保护与持续利用、推动我国苹果产业的优质高效发展及人类的健康具有重要意 义。 新疆野苹果及其红肉变型（Malus sieversii f. neidzwetzkyana)是世界栽培苹 果的祖先种，不仅遗传多样性丰富，而且果实多酚及Ca等功能成分含量均是'红星'苹果 品种的3倍以上，是苹果品质育种的重要资源。但由于农田开垦等原因，新疆野苹果资源 正遭到严重破坏，濒临灭绝；为此，研究人员在对新疆野苹果资源遗传多样性评价研究的基 础上，于2006年在国内率先构建了 '红富士'苹果品种X新疆红肉苹果的F1杂种分离群 体；近期的研究发现，F1群体出现了红/绵肉、红/脆肉、白/绵肉及白/脆肉株系的分离 现象，从杂种F1代群体中能够选育出果个较大、鲜食品质较好、抗氧化能力强、类黄酮含量 高的红肉脆肉株系，并选出了红脆1?10号。以此为技术依托，提出了"功能型苹果"的概 念（在果实中富含类黄酮、可鲜食或加工的保健型苹果），申报了鲜食类功能型苹果"三选 两早一促"的育种法专利技术专利。 除了上述果个较大的红肉脆肉株系外，从杂种F1代群体中还能选育出果个较小 (单果重20-40g)、分离比例极低、鲜食品质较差或很差、但类黄酮含量很高、果肉全红、枝、 叶、花均为紫红色的紫红1?3号（见图1);要以果个小、鲜食品质差的紫红1?3号为杂 交亲本，育成果个大、鲜食品质优良的功能型苹果新品种比较困难。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种利用组织培养法制备类黄酮含量高的苹果愈伤组 织的方法。 本专利技术提供的方法，包括如下步骤： 1)将R6R6基因型苹果外植体在愈伤组织诱导培养基中诱导培养，得到愈伤组织； 2)将所述愈伤组织在继代培养基中继代培养，得到继代愈伤组织； 3)将所述继代愈伤组织在增强培养基中增强培养，得到增强后愈伤组织，即为类 黄酮含量高的苹果愈伤组织。 上述方法中，所述愈伤组织诱导培养基由终浓度为2. 5mg/L2, 4-D、0. 5mg/L6-BA、 0. lmg/L KT、MS液体培养基（表1所示各组分及其终浓度，为有N的）、凝固剂和水组成； 所述继代培养基由终浓度为〇· 3mg/L NAA、1. 0mg/L6-BA、MS液体培养基（表1所 示各组分及其终浓度，为有N的）、凝固剂和水组成； 所述增强培养基由无 N MS培养基、终浓度为0. 3mg/L的NAA、终浓度为1. Omg/L的 6-BA、水和凝固剂组成。 所述无 N MS培养基由表4所示的终浓度的各组分和水组成。 上述方法中，所述凝固剂为为琼脂，所述凝固剂在其所在的培养基中的终浓度均 为 7g/L。 上述方法中，所述诱导培养的条件为先24°C暗培养2周，再光周期为16/8h培养 2?3周，光照强度50umol m^V1 ; 所述继代培养的条件为24°C、16/8h、光照强度50umol nT2s'培养2周； 所述增强培养的条件为：24°C、16/8h、光照强度50umol πΓΥ1、培养15天。 上述方法中，所述类黄酮含量高的苹果愈伤组织为类黄酮含量高于10mg/g的苹 果愈伤组织或类黄酮含量高于15mg/g的苹果愈伤组织或类黄酮含量高于20mg/g的苹果愈 伤组织或类黄酮含量高于25mg/g的苹果愈伤组织或类黄酮含量高于28mg/g的苹果愈伤组 织。 上述方法中，所述R6R6基因型苹果为以新疆红肉苹果为父本，红富士苹果为母本 进行杂交，得到R6R6基因型的杂交子代苹果； 所述R6R6基因型植株具体为紫红1号。 所述R6R6基因型的杂交子代苹果的选取方法为以杂交子代的果肉组织基因组 DNA作为模板，用下述引物对进行PCR扩增，得到504bp大小条带的为R6R6基因型植株： F: 5 ' -GGTGGTCAAAGATGTGTGTTG-3 ' R: 5 ' -CTTATCTTTTGCCTGCTACCC-3 '。 本专利技术的另一个目的是提供一种利用组织培养法制备类黄酮含量高的苹果愈伤 组织的培养基组。 本专利技术提供的培养基组，由单独使用的愈伤组织诱导培养基、继代培养基和增强 培养基组成， 所述愈伤组织诱导培养基由终浓度为2. 5mg/L2, 4-D、0. 5mg/L6-BA、0. lmg/L KT、 MS液体培养基、凝固剂和水组成； 所述继代培养基由终浓度为0. 3mg/L NAA、1. 0mg/L6-BA、MS液体培养基、凝固剂和 水组成； 所述增强培养基由无 N MS培养基、终浓度为0. 3mg/L的NAA、终浓度为1. Omg/L的 6-BA、水和凝固剂组成。 上述各培养基中的凝固剂均为琼脂，且在各培养基中的终浓度可以为7g/L，也可 为能使液体培养基凝固的浓度。 本专利技术的实验证明，本专利技术利用紫红3号叶片诱导出了愈伤组织，在愈伤组织继 代培养过程中发现，激素种类、浓度不同的培养基培养的愈伤组织，其花青苷或类黄酮含量 及其相关基因表达量存在明显差异，高浓度的生长素抑制了类黄酮的生物合成，而无 N培 养基则显著促进了类黄酮的生物合成，制备得到类黄酮含量高的愈伤组织。 【专利附图】【附图说明】 图1为新疆轮胎国家种质资源圃保存的新疆红肉苹果与'红富士'等苹果品种杂 交一代（F1)果实性状分离情况 图2为从F1分离群体选择基因型为R6R6的紫红1号幼叶为愈伤组织诱导的外植 体 图3为从紫红1号幼叶诱导出愈伤组织 图4为低浓度NAA继代培养基（NAAO. 3mg/L+6-BAl. Omg/L)上的红色愈伤和2, 4-D 组合培养基（2, 4-DO. 6mg/L+TDZ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用组织培养法制备类黄酮含量高的苹果愈伤组织的方法，包括如下步骤：1)将R6R6基因型苹果外植体在愈伤组织诱导培养基中诱导培养，得到愈伤组织；2)将所述愈伤组织在继代培养基中继代培养，得到继代愈伤组织；3)将所述继代愈伤组织在增强培养基中增强培养，得到增强后愈伤组织，即为类黄酮含量高的苹果愈伤组织。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：冀晓昊，陈学森，张宗营，王楠，姜生辉，毛志泉，吴树敬，陈晓流，张艳敏，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37