本发明专利技术提供用于病原体的早期检测、病原体的准确鉴定并改进疾病监测的试剂盒和分析方法。更具体地，本发明专利技术公开了免疫分析，其引导在受感染患者的生物液体中针对广泛范围的传染性病原体的抗体快速和同时检测。这种免疫分析涉及含有AGT酶与病毒抗原的融合蛋白在可鉴定的固体支持物(例如，荧光微球)上的共价和定向偶联，所述支持物预先用AGT底物包被。这种偶联由AGT酶在其底物上不可逆的反应所介导。因此，与通过标准胺偶联程序产生的抗原偶联的微球相比，所获得的抗原偶联微球显示特异性抗体的增强捕获。与经典ELISA或放射免疫沉淀分析相比，本发明专利技术的方法具有多重化、最小化生物样本量的能力，并具有针对靶抗体的增强的灵敏度和特异性。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术提供用于病原体的早期检测、病原体的准确鉴定并改进疾病监测的试剂盒和分析方法。更具体地，本专利技术公开了免疫分析，其引导在受感染患者的生物液体中针对广泛范围的传染性病原体的抗体快速和同时检测。这种免疫分析涉及含有AGT酶与病毒抗原的融合蛋白在可鉴定的固体支持物(例如，荧光微球)上的共价和定向偶联，所述支持物预先用AGT底物包被。这种偶联由AGT酶在其底物上不可逆的反应所介导。因此，与通过标准胺偶联程序产生的抗原偶联的微球相比，所获得的抗原偶联微球显示特异性抗体的增强捕获。与经典ELISA或放射免疫沉淀分析相比，本专利技术的方法具有多重化、最小化生物样本量的能力，并具有针对靶抗体的增强的灵敏度和特异性。【专利说明】多重免疫筛选分析
技术介绍
由于疾病的严重程度、高致死性、某些介质（agent)的人类间接触传染性以及对 其中的大多数缺乏有效治疗，传染病和病毒性出血热（VHF)构成显著的公共卫生问题。 其中一些是由高传染性的RNA病毒导致，所述RNA病毒来自几个科，其包括包括 黄病毒科（Flaviviridae)(登革热、黄热病、西尼罗、日本脑炎、蜱传脑炎、丙型肝炎病毒）、 披膜病毒科（Togaviridae)(基孔肯雅（Chikungunya)、罗斯河、马雅罗、西方马型脑炎、东 方马型脑炎、委内瑞拉马型脑炎病毒）、本雅病毒科（Bunyaviridae)(克里米亚-刚果出血 热、裂谷热、施马伦贝格病毒）、杯状病毒科（Caliciviridae)(戊型肝炎病毒）、沙粒病毒科 (Arenaviridae)(拉沙热）和丝状病毒（Filoviridae)(埃博拉、马尔堡）。通常通过与感 染的动物贮主或节肢动物载体接触发生传播。虽然大多数的这些病毒在热带和亚热带有更 高的发生率，但其天然贮主和载体地域扩张、以及增加的国际旅行已经使这些介质在非流 行地区极有可能出现。疫情控制关键取决于快速检测以及介质的准确鉴定，以定义和及时 实现并适当行动。在这种情况下，必须产生和验证用于暴发的早期检测、精确鉴定病原体并 改进疾病监测的工具。 在这方面，在体液中检测抗体构成了病毒引起的疾病、自身免疫性疾病的诊断以 及癌症检测的重要组成部分。事实上，因为已知某些抗体存在与病原体的暴发有关，因此这 些抗体可作为诊断标记物并可引导预后和治疗。对于专门靶向病毒抗原的抗体的情况尤其 如此。 目前用于检测抗体存在的方法包括多种技术，诸如免疫突光显微镜、化学发光分 析、Western印迹、放射免疫沉淀法（RIP)和ELISA。例如，Kim H-J等人的团队最近开 发出一种竞争ELISA用于检测针对在山羊和牛中的裂谷热病毒的抗体（The Journal of Veterinay Medical Science, 2011)。然而，这种技术需要分开测量每种抗体，因而不适用 于在单个生物液体样本中进行多个抗体的平行、快速和高通量分析。因为校准品和所述抗 体在相同的条件下进行分析，通过减少个别分析（如ELISA)之间存在的基质效应，同时平 行检测几种抗体可特别地有用；因此，对在相同样本中存在的多个抗体的测量，其将产生可 比较的结果。 然而，使病原相关抗体的直接鉴定复杂化的是正常血清含有大量在复杂染色模式 中表现其自身的天然抗体（Avrameas S. Immunol. Today 1991)。这些天然抗体的存在可 使得疾病相关抗体与"自身免疫噪声"（即天然存在的自身抗体）的复杂背景的差异复杂 化。这就是为什么大多数之前研究评估一个或几个特异性疾病相关抗体，并通过ELISA或 RIA的方法仅筛选出有限数量的纯化的同源或异源的蛋白作为抗原。不可能建立基于这些 抗体的诊断。在另一方面，因为Western印迹法允许同时筛选不同抗原的广泛谱，Western 印迹法已经发展成为检测抗体的最重要工具。最近能够同时分析Western印迹这些复杂 的染色模式的新技术，是基于数字图像分析。这种技术已成功应用于研究重症肌无力、格 雷夫斯病和实验性葡萄膜炎（Zimmerman CW, Electrophoresis 1995)。还可使用表面增强 激光解吸/电离（SELDI)或基质辅助激光解吸/电离质谱技术，优选SELDI质谱技术（US 2006/166268)在蛋白芯片阵列上检测和测量抗体。然而，这些技术使用大型笨重设备，其是 复杂的和维护昂贵，并且需要大量的生物样本来实现低量抗体的检测。 鉴于上述情况，需要可寻址系统和方法，其可对产生抗体的疾病的分子诊断提供 高通量、成本效益和精确性的进一步改善。本专利技术满足了这些和其它需要。 【专利附图】【附图说明】 图1表示嵌合AGT-抗原蛋白定向偶联至底物包被的微球上。偶联的第一步由通过 氨基偶联将AGT底物BG-PEG-NH2偶联至活化的微球所组成。第二步由使底物包被的微球与 含AGT的融合蛋白（例如，SNAP突变体）相接触所组成，所述酶意欲共价附至其BG-PEG-NH2 底物，即至微球上。 图2显示嵌合SNAP-病毒抗原蛋白的偶联效率（SNAP-DVL EDIII、SNAP-DV2. EDIII、SNAP. DV3. EDIII、SNAP. DV4. EDIII、SNAP-WNV、SNAP-YF、SNAP-JE、SNAP-ZIKA)，接着 是抗-SNAP抗体。 图3比较了用于检测纯化的单克隆抗-DV2抗体对嵌合SNAP-DV2.EDIII蛋白的免 疫分析实验的灵敏度，所述嵌合SNAP-DV2.EDIII蛋白通过hAGT蛋白的底物（本专利技术的偶 联）缀合至微球、或者通过标准胺偶联方法，例如Bio-Plex胺偶联试剂盒BI0RAD进行偶 联。 图4比较用于检测纯化的单克隆抗-DV1抗体对嵌合SNAP-DV1. EDIII蛋白的免 疫分析实验的灵敏度，所述嵌合SNAP-DV1. EDIII蛋白以单重格式缀合至微球，或者与其它 嵌合 SNAP-病毒 Ag 蛋白（SNAP-DV2. EDIII、SNAP. DV3. EDIII、SNAP. DV4. EDIII、SNAP-WNV、 SNAP-YF、SNAP-JE、SNAP-TBE)以多重格式偶联至微球。 图5显示用于检测纯化的单克隆抗-WNV抗体的稀释液对偶联至微球的嵌合 SNAP-病毒 Ag 蛋白（SNAP-DV1. EDIII、SNAP-DV2. EDIII、SNAP. DV3. EDIII、SNAP. DV4. EDIII、 SNAP-WNV、SNAP-YF、SNAP-JE、SNAP-TBE)的多重免疫分析实验的反应性和特异性。 图6显示以多重免疫分析对偶联至微球的嵌合SNAP-病毒Ag蛋白（SNAP-DV1. EDIII、SNAP-DV2. EDIII、SNAP. DV3. EDIII、SNAP. DV4. EDIII、SNAP-WNV、SNAP-YF、SNAP-JE、 SNAP-WSL、SNAP-R0CI0、SNAP-MVE、SNAP-SLE、SNAP-ZIKA)进行的在小鼠多克隆血清中针对 DV3的抗-DV3 IgG检测（A)以及在小鼠多克隆血清中针对YF的抗-YF IgG检测（B)的反 应性和特异性。 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测存在于来自受试者的生物样本中至少两种不同靶抗体的体外分析方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供第一融合蛋白，其包括：‑含有由第一靶抗体识别的第一表位的多肽，以及‑具有O6‑烷基鸟嘌呤‑DNA烷基转移酶活性的AGT多肽；(b)使所述第一融合蛋白与第一固体支持物相接触，所述支持物与所述AGT多肽的底物共价偶联；(c)获得与第一靶抗体识别的第一表位共价偶联的第一固体支持物；(d)提供第二融合蛋白，其包括：‑含有第二表位的多肽，所述第二表位由第二靶抗体而不是由所述第一靶抗体所识别，以及‑具有O6‑烷基鸟嘌呤‑DNA烷基转移酶活性的AGT多肽；(e)使所述第二融合蛋白与第二固体支持物相接触，所述支持物与所述AGT多肽的底物共价偶联；(f)获得第二固体支持物，其与由第二靶抗体、而不是由所述第一靶抗体识别的第二表位共价偶联，其中所述第一和第二固体支持物可彼此特异性地鉴定；(g)使所述生物样本与获自步骤(c)和(f)的第一和第二固体支持物相接触；(h)检测所述至少两种靶抗体的存在。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：JC·马努圭拉，J·瓦努韦根，P·德普雷斯，S·保卢斯，
申请(专利权)人：巴斯德研究所，
类型：发明
国别省市：法国;FR
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