克伦特罗适配体与检测克伦特罗的适配体电化学生物传感器制造技术

本发明专利技术涉及一种克伦特罗适配体以及检测克伦特罗的适配体电化学生物传感器，以及该传感器的制备方法与检测方法。本发明专利技术所述的克伦特罗适配体为含有GGATATTGG序列、长度为13-18个碱基的单链DNA探针，且3’端修饰了3’-NH2-(CH2)7-。该传感器提高了检测克伦特罗的灵敏性，最低可以检测出1.0pg/mL的克伦特罗；大大降低了检测克伦特罗的成本，操作简单方便，可实现对克伦特罗的快速检测。

【技术实现步骤摘要】
克伦特罗适配体与检测克伦特罗的适配体电化学生物传感器
本专利技术属于检测
，涉及一种克伦特罗适配体以及检测克伦特罗的适配体电化学生物传感器，以及该传感器的制备方法与检测方法。
技术介绍
克伦特罗(Clenbuterol,CLB)，化学命名为Α-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3，5-二氯苯甲醇盐酸盐，分子量为277.19，分子式C12H18Cl2N2O，是一种人工合成的化学物质，化学结构式如下：克伦特罗理化性质稳定，在较高温度下不易分解，动物摄入后主要以原药形式残留在肌肉组织和内脏器官中。残留在畜禽产品中的克伦特罗，通过食物链在人体内富集。研究表明，长期食用残留克伦特罗的食品后，会出现头痛、胸闷、心悸、肌肉震颤、四肢麻木等不良反应，严重者甚至危及生命。中华人民共和国农业部第235号公告明确规定克伦特罗及其盐、酯在动物性食品中不得检出。目前常用的克伦特罗残留检测方法有高效液相色谱法，液-质联用法，气-质联用法，酶联免疫法，电化学免疫传感器等。尽管这些方法有很高的选择性和敏感性，但需要昂贵的仪器或者长时间的样品预处理以及复杂的测试流程。因此，建立一种快速、灵敏、低成本的克伦特罗检测技术具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可用于克伦特罗含量快速检测的生物传感器及其组装方法。该生物传感器灵敏度更高，响应时间更快，并且可快速用于克伦特罗检测。本专利技术的第一个目的是提供一种克伦特罗适配体。本专利技术所述的克伦特罗适配体为含有GGATATTGG序列、长度为13-18个碱基的单链DNA探针，且3’端修饰了3’-NH2-(CH2)7-。本专利技术的第二个目的是提供一种检测克伦特罗的适配体电化学生物传感器。本专利技术所述的检测克伦特罗的适配体电化学生物传感器，含有本专利技术所述的克伦特罗适配体。本专利技术的第三个目的是提供一种适配体电化学生物传感器的制备方法。本专利技术所述的适配体电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：(1)裸金电极表面的抛光及活化处理：将裸金电极用氧化铝粉末打磨，用超纯水超声清洗去除氧化铝粉末，将清洗好的裸金电极浸入新鲜配制的热的Piranha溶液于20-25℃下活化10分钟，得到活化的裸金电极；(2)活化电极的适配体修饰：合成如本专利技术所述的适配体，配制100μmol/L的适配体溶液，加入到NaCl溶液中配制成2μmol/L适配体组装液；将步骤(1)所得的活化的裸金电极浸入适配体组装液中，4℃下组装24小时，得到所述的适配体电化学生物传感器。本专利技术的第四个目的是提供一种本专利技术所述的适配体电化学生物传感器的用途，即将本专利技术所述的适配体电化学生物传感器用于克伦特罗的检测。本专利技术的第五个目的是提供一种检测克伦特罗的方法，该方法是基于本专利技术所述的适配体电化学生物传感器的检测方法。本专利技术所述的适配体电化学生物传感器的检测克伦特罗的方法，包括以下步骤：(1)对克伦特罗标准溶液进行检测，建立标准曲线：将所述的适配体电化学生物传感器作为工作电极，Ag/AgCl(饱和KCl)电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极；将所述的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗，去除未结合的适配体，然后置于浓度为5mmol/L的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]为1：1的含0.1mol/LKCl的电解液中，进行交流阻抗分析，初始电位为0.22V，频率为0.1-1.0×105Hz，得到适配体电化学生物传感器的交流阻抗图谱及其阻抗值Ret0；将交流阻抗分析后的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗后浸入浓度1.0pg/mL的克伦特罗水溶液中，室温孵育15分钟，反应后用超纯水冲洗去除非特异性吸附的克伦特罗，然后置于浓度为5mmol/L的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]为1：1的含0.1mol/LKCl的电解液中，进行交流阻抗分析，初始电位为0.22V，频率为0.1-1.0×105Hz，得到浓度为1.0pg/mL的克伦特罗标准液的交流阻抗图谱及其阻抗值Ret1；同理，将上述修饰电极依次放入浓度5.0pg/mL、10.0pg/mL、50.0pg/mL、1.0×102pg/mL、5.0×102pg/mL、1.0×103pg/mL、5.0×103pg/mL的克伦特罗标准液中，分别于室温下孵育反应15分钟，分别进行交流阻抗分析，记录其对应的交流阻抗图谱及阻抗值Retn(n＝2,3…8)，并计算各标准液相对初始的适配体电化学生物传感器的阻抗变化值△Ret，△Ret为各标准液对应的阻抗值Retn(n＝1,2,3…8)减去适配体电化学生物传感器对应的阻抗值Ret0；以浓度为1.0pg/mL、5.0pg/mL、10.0pg/mL、50.0pg/mL、1.0×102pg/mL、5.0×102pg/mL、1.0×103pg/mL、5.0×103pg/mL的克伦特罗标准液浓度的对数为横坐标，以这8种标准液对应的阻抗变化值△Ret为纵坐标作图，建立标准曲线；(2)对含克伦特罗的样品溶液进行定量检测：根据GB/T5009.192-2003所述方法对样品中的克伦特罗进行提取纯化；将得到的克伦特罗干粉用超纯水溶解后过0.45μM滤膜，然后进行电化学检测；将交流阻抗分析后的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗后浸入从样品溶液中提取纯化得到的克伦特罗水溶液中，室温孵育15分钟，反应后用超纯水冲洗，然后置于浓度为5mmol/L的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]为1：1的，含浓度0.1mol/LKCl的电解液中，进行交流阻抗分析，初始电位为0.22V，频率为0.1-1.0×105Hz，得到样品中克伦特罗溶液检测的交流阻抗图谱及其阻抗值Rets；通过步骤(1)建立的标准曲线，计算出Rets-Ret0对应的克伦特罗浓度，即为样品中克伦特罗的浓度。本专利技术的有益效果在于：(1)提供了一种对目标克伦特罗非常敏感的适配体作为分子识别元件。与抗体相比，核酸适配体具有靶分子范围广，亲合力强，特异性高，稳定性好，制备、修饰方便快速，变性复性可逆，分子量小，无毒性、无免疫原性、组织渗透性好等优点。(2)基于该适配体，制备得到相应的适配体电化学生物传感器，可以将克伦特罗目标物的存在转变为电信号进行快速检测。它将电化学方法的高灵敏性和适配体高度特异性识别作用相结合，制备简单、灵敏度高、检测费用低、易于微型化、可再生，不受样品中脂血、溶血情况干扰。(3)本专利技术利用电化学传感技术构建了一种新型的快速检测克伦特罗的技术，该技术是一种检测快速，检测成本低，检测灵敏性高，操作简单的检测技术。本专利技术采用可特异性识别克伦特罗的核酸适配体应用于电化学传感器，大大提高了检测的灵敏性和特异性，降低了检测成本和检测方案的复杂性。附图说明图1为本专利技术所述的克伦特罗适配体修饰电极在不同浓度克伦特罗标准溶液中检测的交流阻抗图谱。图2为本专利技术所述的克伦特罗适配体修饰电极在不同浓度克伦特罗标准溶液中检测的信号变化趋势图。图3为本专利技术所述的克伦特罗适配体修饰电极在克伦特罗标准品溶液检测得到的标准曲线图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术做进一步地描述。实施例一：适配体电化学生物传感器的构建(1)裸金电极表面的抛光及活化处理将裸金电极用0.3μm的氧化铝粉末打磨10分钟，再用0.05μm本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种克伦特罗适配体，其特征在于，所述适配体为含有GGATATTGG序列、长度为13‑18个碱基的单链DNA探针，即XnGGATATTGGYm，其中，X和Y表示任意核酸碱基，n和m表示整数。

【技术特征摘要】
1.一种克伦特罗适配体，其特征在于，所述适配体为序列如SEQIDNO：1-10任一所示的单链DNA探针。2.根据权利要求1所述的克伦特罗适配体，其特征在于：所述适配体的3’端进行氨基修饰。3.根据权利要求2所述的克伦特罗适配体，其特征在于：所述3’端氨基修饰基团为-NH2-(CH2)7-。4.一种检测克伦特罗的适配体电化学生物传感器，其特征在于：所述的电化学生物传感器中含有如权利要求1至3之一所述的适配体。5.如权利要求4所述的适配体电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）裸金电极表面的抛光及活化处理：将裸金电极用氧化铝粉末打磨，用超纯水超声清洗去除氧化铝粉末，将清洗好的裸金电极浸入新鲜配制的热的Piranha溶液于20-25℃下活化10分钟，得到活化的裸金电极；（2）活化电极的适配体修饰：合成如权利要求1至3之一所述的适配体，配制100μmol/L的适配体溶液，加入到NaCl溶液中配制成2μmol/L适配体组装液；将步骤（1）所得的活化的裸金电极浸入适配体组装液中，4℃下组装24小时，得到所述的适配体电化学生物传感器。6.一种基于如权利要求4所述的适配体电化学生物传感器的检测克伦特罗的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）对克伦特罗标准溶液进行检测，建立标准曲线：将所述的适配体电化学生物传感器作为工作电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极；将所述的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗，去除未结合的适配体，然后置于浓度为5mmol/L的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]为1：1的含0.1mol/LKCl的电解液中，进行交流阻抗分析，初始电位为0.22V，频率为0.1-1.0×105Hz，得到适配体电化学生物传感器的交流阻抗图谱及其阻抗值Ret0；将交流阻抗分析后的适配体电化学生物传感器用超纯水冲洗后浸入浓度1.0pg/mL的克伦特罗水溶液中，室温孵育15分钟，反应后用超纯水冲洗去除非特异性吸附的克伦特罗，然后置于浓度为5mmol/L的K3[F...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘大岭，陈丹，姚冬生，谢春芳，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44