超嗜热聚合酶可实现的邻近延伸分析制造技术

本发明专利技术涉及针对样品中分析物进行的基于邻近探针的检测分析(“邻近分析”)，特别是邻近探针延伸分析(PEA)，且尤其是涉及对降低非特异性“背景”信号的方法进行的改进，其中改进包括在这样的分析中使用超嗜热聚合酶，所述方法包括：(a)将样品与至少第一和第二邻近探针的至少一组接触，每个探针包括分析物结合结构域和核酸结构域，并能够同时结合至分析物；(b)在邻近探针与分析物结合时，使邻近探针的核酸结构域彼此相互作用，其中所述相互作用包括双链体的形成；(c)延伸所述双链体的至少一个核酸结构域的3’端以生成延伸产物，其中，延伸反应包括将分析的温度提高至超过室温并使用聚合酶，所述聚合酶的特征在于40℃时其具有小于最大酶活性的20％的活性且25℃时其具有小于最大酶活性的10％的活性，其中，所述聚合酶的最大活性的最适温度是高于40℃，且所述聚合酶选自强烈火球菌(Pfu)DNA聚合酶和沃氏火球菌(Pwo)DNA聚合酶，或者它们的衍生物或突变体，优选地其中所述衍生物是序列-修饰的衍生物；和(d)扩增和检测延伸产物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】超嗜热聚合酶可实现的邻近延伸分析
本专利技术涉及一种针对样品中分析物进行的基于邻近探针的检测分析(“邻近分析”)，具体涉及邻近探针延伸分析(PEA)。特别地，本专利技术涉及对方法的改进，以便减少非特异性“背景”信号，所述非特异性“背景”信号出现在所有样品类型中，并且在复杂的生物样品中可能是特别有问题的。本专利技术的方法还可产生有利于所述分析的自动化和再现性的简化方法。所述改进包括在室温下具有最小活性或无活性的聚合酶，特别是超嗜热聚合酶，在上述分析中的使用。本专利技术还提供了一种试剂盒，包含聚合酶，其是用于本专利技术方法的、在室温下具有最小活性或无活性的聚合酶。
技术介绍
在邻近探针延伸分析中使用了邻近探针，所述邻近探针结合于分析物并具有核酸结构域(或标记)，所述核酸结构域与所述分析物结合以邻近依赖性方式相互作用。所述相互作用通常通过一个或多个核酸双链体的形成(通过核酸结构域的杂交)进行，所述相互作用使得至少一个核酸结构域从其3’端延伸。该延伸产物形成可检测的，优选可扩增的，核酸检测产物或检测标记，借助其可以检测到所述分析物。
技术实现思路
本专利技术中，在室温下具有最小活性或无活性的聚合酶可在所述聚合酶无活性或具有最小活性的条件下加入，例如，在实验室条件下。所述聚合酶可以在产生延伸产物所必需的其它分析组分之前加入，或者与其它分析组分同时加入，或者在其它分析组分之后加入。因此，人们认为，除非改变反应条件，特别是温度条件，使聚合酶在该参数条件下是有活性的，即具有可检测到的活性或者高于最小聚合物活性，否则在室温下具有最小活性或无活性的聚合酶不能够与样品中的核酸分子，例如邻近探针的核酸结构域，发生相互作用产生延伸产物。本专利技术中，在室温具有最小活性或无活性的聚合酶同时包含其它反应组分，可减少分析方法的步骤数目，即减少了从业者与反应混合物之间相互接触的次数，所述其它反应组分例如是靶标分析物的延伸、扩增和检测所需的组分。这有利于产生一致的分析结果。在室温下具有最小活性或无活性的聚合酶不论是在其它分析组分之前加入，还是与其它分析组分同时加入或在其后加入，所述聚合酶的使用都能够使从业者不必直接接触反应混合物就可控制延伸产物的产生，即封闭管反应。在本专利技术的方法中，直到反应条件有利于激发聚合酶活性，才会产生延伸产物。这使得样品能够与分析组分一起进行培养足够的时间，包括在聚合酶存在下进行培养，以便使邻近探针的核酸结构域之间的非特异性相互作用最小化，从而增强了分析的特异性和灵敏性。通常，邻近分析依赖于“邻近探测”原理，其中通过多个(即两个或多个，通常是两个或三个)探针的结合来检测分析物，当所述探针通过结合于分析物(因此是“邻近探针”)而进入邻近时，使得信号生成。一般地，邻近探针中的至少一个包括连接于探针的分析物结合结构域(或部分)的核酸结构域(或部分)，并且信号的生成涉及核酸部分和/或由其它探针(或多个探针)携带的另外的功能部分之间的相互作用。因此信号生成取决于探针之间(更具体地由它们携带的核酸或其它功能部分/结构域之间)的相互作用，因此仅当两个(或多个)必须的探针都结合于分析物时才生成信号，从而向检测系统提供改善的特异性。近年来发展了邻近探测的概念，现在基于该原则的许多分析在本领域是熟知的。例如，“邻近探针延伸分析”或“邻近延伸分析”(PEA)是指具体类型的分析，所述分析利用核酸结构域的延伸，即核苷酸模板化地加入核酸分子的末端，以生成可检测的信号。基于邻近探针的检测分析，特别是邻近延伸分析使得能够通过将样品中的一种或多种分析物的存在的形式转化成可以容易地检测的或者可定量的基于核酸的信号，以灵敏、快速且方便地检测或者定量该一种或多种分析物，并且所述的分析可以按照均质或异质形式进行。本领域的邻近探针通常成对使用，并且各自地由对靶标分析物具有特异性的分析物结合结构域和功能结构域所构成，所述功能结构域例如是偶联在其上的核酸结构域。所述分析物结合结构域例如可以是核酸“适体”(Fredriksson等人(2002)，自然生物技术20:473-477)(Fredrikssonetal(2002)NatBiotech20:473-477)或可以是蛋白质的，诸如单克隆或多克隆抗体(Gullberg等人(2004)，美国科学院院刊101:8420-8424)(Gullbergetal(2004)ProcNatlAcadSciUSA101:8420-8424)。每个邻近探针对的各自的分析物结合结构域可以针对分析物上的不同结合位点具有特异性，所述分析物可以由单一分子或者相互作用的分子复合物构成，或者可以具有相同的特异性，例如在靶标分析物存在的情况下作为多聚体存在。当邻近探针对变得彼此紧密邻近时，这主要当两个均结合于相同分析物分子上的其各自的位点时发生，功能结构域(例如，核酸结构域)能够相互作用。在本专利技术的上下文中，例如，核酸结构域可以含有彼此互补的区域，因此邻近探针对的核酸结构域可以杂交以形成双链体。一个或多个结构域可以延伸以形成新的核酸序列，这通常借助由其它邻近探针的核酸结构域模板化的聚合反应来进行。由此，生成的新核酸序列用于报告样品中分析物的存在与否或含量，并且生成的新核酸序列可以被定性或定量检测，例如通过实时定量PCR(q-PCR)定量检测。基于邻近探针的分析存在许多变化。例如，国际专利WO01/61037，美国专利6,511,809和国际专利WO2006/137932中对邻近延伸分析进行了描述，并且基于邻近探针的分析的异质(即分析物首先借助特异性分析物结合试剂固定在固体基质上)和均质(即在溶液中)形式在如下文献中被公开：国际专利WO01/61037，国际专利WO03/044231，国际专利WO2005/123963，Fredriksson等人(2002)自然生物技术20:473-477(Fredrikssonetal(2002)NatBiotech20:473-477)和Gullberg等人(2004)美国科学院院刊101:8420-8424(Gullbergetal(2004)ProcNatlAcadSciUSA101:8420-8424)。虽然通常使用邻近探针对，但是邻近探针检测分析的修饰已描述于例如国际专利WO01/61037，国际专利WO2005/123963和国际专利WO2007/107743，其中使用三种邻近探针来检测单个的分析物分子。例如，第三邻近探针可以用来提供可以与前两种邻近探针的核酸结构域相互作用的另外的核酸结构域。除了对邻近探针检测分析的修饰，邻近探针本身结构的修饰已描述于例如国际专利WO03/044231中，其中使用了多价邻近探针。这样的多价邻近探针包括至少两个，但是多达100个的分析物结合结构域，所述分析物结合结构域缀合于至少一个核酸，优选多于一个核酸。基于邻近探针的检测分析，且特别是邻近延伸分析，已经证明在许多不同的应用中在蛋白质的特异性和灵敏性检测中是非常有用的，所述应用例如是检测弱表达或低丰度蛋白质。然而，就分析的灵敏度和特异性两方面而言，这样的分析都不是没有其问题，并且存在改进空间。例如上述邻近延伸分析的传统邻近分析的灵敏度受两个主要因素的限制：(i)分析物结合结构域对靶标分析物的亲和力，和(ii)由非结合探针特别是探针本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测样品中分析物的方法，包括：(a)将所述样品与至少第一和第二邻近探针的至少一组接触，每个探针包括分析物结合结构域和核酸结构域，并能够同时结合至分析物；(b)在所述邻近探针与所述分析物结合时，使邻近探针的核酸结构域彼此相互作用，其中所述相互作用包括双链体的形成；(c)延伸所述双链体的至少一个核酸结构域的3’端以生成延伸产物，其中，延伸反应包括将分析的温度提高至超过室温并使用聚合酶，所述聚合酶的特点是40℃时其具有小于最大酶活性的20％的活性，且25℃时其具有小于最大酶活性的10％的活性，其中，所述聚合酶的最大活性的最适温度是高于40℃，且其中所述聚合酶选自强烈火球菌(Pfu)DNA聚合酶和沃氏火球菌(Pwo)DNA聚合酶，或者它们的衍生物或其突变体，优选地其中所述衍生物是序列‑修饰的衍生物；和(d)扩增和检测延伸产物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.01.30 GB 1201547.51.一种检测样品中分析物的非诊断目的的方法，包括：(a)将所述样品与至少第一和第二邻近探针的至少一组接触，每个探针包括分析物结合结构域和核酸结构域，并能够同时结合至分析物；(b)在所述邻近探针与所述分析物结合时，使邻近探针的核酸结构域彼此相互作用，其中所述相互作用包括双链体的形成；(c)延伸所述双链体的至少一个核酸结构域的3’端以生成延伸产物，其中，延伸反应包括将分析的温度提高至至少30℃并使用聚合酶，所述聚合酶的特点是40℃时其具有小于或等于最大酶活性的20％的活性，且25℃时其具有小于或等于最大酶活性的10％的活性，其中，所述聚合酶的最大活性的最适温度是高于40℃；和(d)扩增和检测延伸产物；其中，在步骤(c)中，所述聚合酶选自PfuDNA聚合酶，PwoDNA聚合酶，或者，所述聚合酶由SEQIDNO:2的多肽序列构成。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述聚合酶的特点是在40℃时，其具有小于或等于最大酶活性的15％的活性。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述聚合酶的特点是在40℃时，其具有小于或等于最大酶活性的10％的活性。4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述聚合酶的最大活性的最适温度是至少70℃。5.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述分析的温度提高到至少35℃。6.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述分析的温度提高到至少40℃。7.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述分析的温度提高到至少45℃。8.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述分析的温度提高到至少50℃。9.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述分析的温度提高到至少55℃。10.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中，邻近探针组中的至少一个邻近探针是展开邻近探针，包括偶联至具有至少一个发夹结构的核酸结构域的分析物结合结构域。11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述展开邻近探针的核酸结构域的发夹结构包括核酸结构域的游离3’可延伸端。12.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·弗雷德里克松，M·伦德伯格，A·埃里克松，E·伦内尔狄更斯，
申请(专利权)人：欧凌科公司，
类型：发明
国别省市：瑞典;SE