一种双识别抗体片段的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及医药卫生领域，提供了一种双识别抗体片段的制备方法。本发明专利技术得到的抗体由两个不同单抗的Fab’片段组成，一端可识别待测抗原，另一端识别运载示踪物的无关蛋白。通过结合高比例示踪物的无关蛋白，放大检测信号，提高检测灵敏度。通过本发明专利技术提供的方法制备的抗体，可应用于化学发光、荧光、酶联免疫分析领域。

【技术实现步骤摘要】
一种双识别抗体片段的制备方法及其应用
本专利技术属于医药领域，涉及到一种双识别抗体抗体的制备方法，通过该方法得到的双识别抗体，可广泛应用于化学发光免疫法检测、荧光免疫层析法检测、酶联免疫法检测等领域，能够大幅度提高原有方法学的检测灵敏度。
技术介绍
传统的免疫分析法如化学发光免疫法、酶联免疫法以及荧光免疫层析法都是将示踪物直接标记抗体或抗原用于免疫检测，而示踪物与抗原、抗体的偶联，会在一定程度上影响原物质的活性，从而对检测敏感性造成一定的影响。酶联免疫吸附剂测定法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)简称酶联免疫法，其中心是让抗原或抗体与酶连接形成酶标抗体，通过显色来检测。这种酶标抗原或者抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。但在标记的过程中，首先过碘酸钠氧化酶形成醛化酶，醛化酶再与抗体或抗原分子氨基相连，该过程中过碘酸钠会对抗体或抗原的免疫活性造成影响，同样会影响免疫灵敏度。同样，化学发光免疫法标记到抗体上的吖啶酯、异鲁米诺等发光物以及荧光免疫层析法中标记到抗体上的荧光物Cy3、Cy5，当标记比例小的时候不影响抗体的活性，但是发光或者荧光的信号比较小，导致试剂的灵敏度不够高，但标记比例大的时候这些示踪物会结合到抗体识别抗原的Fv区域，从而导致其识别能力下降。因此，一种既能高效识别抗原又能携带高比例示踪物的改造抗体便成为了解决上述种种矛盾的必需。以降钙素原(Piocalcitonin，PCT)为例，PCT作为近些年来新发现的炎症指标，目前已经发现它在细菌感染时升高，并且其升高程度与感染严重程度、病情预后密切相关。近年来随着研究的深入，发现在细菌感染初期，已经有PCT低水平的升高，当PCT水平大于50pg/mL而小于250pg/ml时，预示着病人有局部感染，当PCT水平大于0.25ng/mL时，建议进行抗生素治疗。正常人体内PCT的含量极低，小于50pg/mL。因此在感染初期，尤其是呼吸道感染的病人，大部分为轻微感染，普通的检测方法很难及时的测定PCT的含量变化，从而会给医生的判断带来困惑，耽误了及时的治疗方案。本专利技术利用被胃蛋白酶消化后的抗体中铰链区的二硫键比Fab’中连接H链和L链的二硫键容易断裂为基础，利用低浓度的还原剂进行切割，从而制备两种识别不同抗原的抗体Fab’，将两种Fab'按一定比例混合并让其铰链区的二硫键氧化重新形成二硫键，从而构成重组抗体片段F(ab')2。这种重组抗体，一端识别待测抗原，另一端识别运载示踪物的无关蛋白，无关蛋白上携带高比例的示踪物，进而相当于间接的将示踪物标记到检测用的抗体上，高比例的示踪信号保证了检测信号极大幅度的增强，同时解决了示踪物对抗体识别能力的影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种双识别抗体片段的制备方法，该方法能够应用于化学发光免疫法检测、荧光免疫层析法检测、酶联免疫法检测等领域，能够大幅度提高原有方法学的检测灵敏度。所述的双识别抗体片段，可同时识别两种不同抗原，其中一端Fab'-a识别待测抗原，另一端Fab'-b识别运载示踪物的无关蛋白，无关蛋白上携带高比例的示踪物，进而相当于间接的将示踪物标记到检测用的抗体上，当待测物质中存在抗原时，此抗体片段会和待测抗原以及另外一株针对该抗原的捕获抗体反应形成夹心复合物，此时介入到夹心复合物中的无关蛋白，由于其结合了高比例的示踪物，从而保证了检测信号极大幅度的增强，同时解决了示踪物对抗体识别能力的影响，根据标记物质的不同选择特定的示踪方法，再结合标准曲线计算出待测物质中抗原的含量。该双识别抗体片段由两个来自不同的单抗的Fab’(Fab'-a和Fab'-b)组成。所述的Fab'-a片段来源于一株待测抗原的单克隆抗体，是经胃蛋白酶消化及还原试剂打开铰链区二硫键得到的Fab'片段。所述的Fab'-b来源于一种无关蛋白的单克隆抗体，是经胃蛋白酶消化及还原试剂打开铰链区二硫键得到的Fab'片段。所述的待测抗原是降钙素原、心肌肌钙蛋白I、心肌肌钙蛋白T或N-端脑钠肽前体等生物标志物。所述的无关蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白等天然或重组蛋白，是指分子量在10KDa到300KDa之间的，与待测抗原无相互作用的，能标记示踪物的蛋白。所述示踪物为吖啶酯、ABEI、luminol、HRP、AP、Cy3、Cy5、647、FITC等物质中的一种或几种。根据本专利技术所述的双识别抗体制备方法，所得的双识别抗体可应用于化学发光免疫法检测、荧光免疫层析法检测、酶联免疫法检测等领域，可用于定量检测人体尿液、脑积液、血液等体液或以其他形式存在的待检抗原，能够大幅度提高原有方法学的检测灵敏度。所述的双识别抗体的制备方法，以制备抗降钙素原-抗BSA双识别抗体为例，如图1所示，包括如下步骤：1.取NHS-sepharose4FF(购自GE公司)10mL，用200mL1mMHCl溶液洗涤，除去异丙醇，平均分成两份；将40mgpH7.4PBS平衡的PCT抗原(购自Fitzgerald公司)及BSA(购自Sigma公司)分别与预先洗好的5mLNHS活化树脂混匀，室温孵育2h。2.0.1MTris-HCl(pH8.0)缓冲液封闭1h。用5倍柱体0.1MHAc-NaAc(0.5MNaCl，pH4.0)和0.1MTris-HCL(0.5MNaCl，pH8.0)缓冲液交替洗，重复5次，即为做好的PCT抗原抗体亲和柱和BSA抗原抗体亲和柱。3.将一株抗降钙素原(PCT)的单抗1与另一株抗BSA的单抗2，在0.1MHAc-NaAc(pH4.5)透析3h，按照抗体与胃蛋白酶50：1比例，加入新配制的2mg/mL胃蛋白酶溶液，37℃震荡反应1h。4.反应结束后，加入1MTris-HCl(pH8.5)进行终止反应。将单抗1、单抗2反应液分别上样预先平衡好的PCT抗原抗体亲和柱和BSA抗原抗体亲和柱(平衡缓冲液均为0.1MTris-HCl，pH8.5，2MNaCl)。用50倍体积Tris-HCl缓冲液进行流洗，至洗出的蛋白含量不再减少为止。5.用洗脱缓冲液(Gly缓冲液，pH2.0)分别对两亲和柱进行洗脱，准备两支装有中和缓冲液(1MTris-HCl，pH8.0)的离心管分别收集蛋白含量高的部分，即为单抗1和单抗2的F(ab′)2片段(图1所示的3和4)，其中中和缓冲液以收集蛋白体积1/10加入。将收集抗体片段于20mMPBS(pH7.4)透析4次，每次4-6h。6.将透析后的3和4分别加入还原剂β-巯基乙醇(终浓度为5mM)，37℃孵育30min。取少量的还原反应液，经非还原SDS-PAGE鉴定还原效果。3和4还原后的片段即为5和6。7.将5和6片段等摩尔量混合，在含0.1mM氧化型谷胱甘肽的20mMPBS缓冲液中4℃透析过夜，使片段5和6随机组合。8.将透析后的5和6组合液上样于预先用20mMPBS(pH7.4，2MNaCl)平衡的PCT抗原抗体亲和柱，用20mMPBS洗亲和柱，直至洗出的蛋白含量不再减少为止。9.同步骤5，用洗脱缓冲液洗脱并收集抗体。用PBS透析抗体共三次，每次间隔至少4h。10.按照步骤8、9所述纯化方法，将透析后的溶液再次上样包被BSA的抗原抗体亲和柱。洗脱收集，并用PBS透析。11.透析后，抗体片段于4℃，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双识别抗体的制备方法及应用，其特征在于其可同时识别两种不同抗原，当待测物质中存在抗原时，此抗体片段会和待测抗原以及另外一株针对该抗原的捕获抗体反应形成夹心复合物，此时携带高比例示踪物无关蛋白也会通过免疫反应介入到夹心复合物中，由于其结合了高比例的示踪物，从而保证了检测信号极大幅度的增强，同时解决了示踪物对抗体识别能力的影响，根据标记物质的不同选择特定的示踪方法，再结合标准曲线计算出待测物质中抗原的含量。

【技术特征摘要】
1.一种双识别抗体，其特征在于，其具有两端不同的Fab’区域，可同时识别两种不同抗原；所述两端不同的Fab’区域中，其中一端Fab'-a识别待测抗原，另一端Fab'-b识别运载示踪物的无关蛋白，Fab'-a及Fab'-b铰链区的巯基经氧化形成二硫键，从而构成重组抗体片段；所述的无关蛋白是牛血清白蛋白、卵清白蛋白，分子量在10KDa到300KDa之间，与待测抗原无相互作用，能标记示踪物；当待测物质中存在抗原时，此抗体片段会和待测抗原以及另外一株针对该抗原的捕获抗体反应形成夹心复合物，此时携带高比例示踪物无关蛋白也会通过免疫反应介入到夹心复合物中，由于其结合了高比例的示踪物，从而保证了检测信号极大幅度的增强，同时解决了示踪物对抗体识别能力的影响，根据标记物质的不同选择特定的示踪方法，再结合标准曲线计算出待测物质中抗原的含量；所述待测抗原是降钙素原、心肌肌钙蛋白I、心肌肌钙蛋白T或N-端脑钠肽前体。2.根据权利要求1所述的双识别...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶森，
申请(专利权)人：叶森，
类型：发明
国别省市：江苏;32