杂色曲菌素适配体以及相关的电化学生物传感器制造技术

本发明专利技术涉及一种杂色曲菌素(Ver A)适配体以及检测Ver A的适配体电化学生物传感器。本发明专利技术所述的杂色曲菌素适配体为含有核心序列AAGCCGCAC的13～21个碱基的单链DNA探针。本发明专利技术所述的检测杂色曲菌素适配体的核酸适配体电化学传感器，包括所述的杂色曲菌素适配体。本发明专利技术建立了一种电化学适配体生物传感器检测Ver A的方法，为Ver A的检测提供了一种新的方法和途径，具有特异性强，简便灵活，分析速度快，检测成本低廉等优点。

【技术实现步骤摘要】
杂色曲菌素适配体以及相关的电化学生物传感器
本专利技术属于检测
，涉及一种杂色曲菌素(VerA)适配体以及检测VerA的适配体电化学生物传感器。
技术介绍
杂色曲菌素(VerA，versicolorinA)即1,6,8-三羟基-2-羟甲基蒽醌，是黄曲霉毒素B1及杂色曲霉素(sterigmytocystin，ST)合成代谢过程中的重要前体物，其结构含有与AFB1和ST相同的毒性基团—双呋喃环。研究表明对粮食在储藏过程中的VerA进行监测，有利于对尚未检出或仅低水平检出黄曲霉毒素污染的粮食起到预警的作用。此外，20世纪80年代，Wong等初步研究了VerA的急性毒性和致畸变性，其LD50(小鼠静脉注射)为20mg/kg，致突变剂量(amestest)为800ng/皿，因而杂色曲菌素的毒性不容忽视。随着国内外对AFB1、ST的危害性重视程度日益加深，很多高灵敏性的分析检测方法也随之成熟，但对VerA的污染和检测关注仍然不足。目前主要的分析检测的VerA方法包括HPLC(高效液相色谱)和TLC(薄层色谱)。HPLC方法分辨率高、稳定性好、成本较低，但是样品的预处理过程较繁琐，操作技术水平要求高，对样品的前处理要求苛刻，灵敏度不够高；而TLC方法操作简单、无需复杂仪器，但其灵敏度不高，可靠性也不强。相比而言，酶生物传感器具有耗时短，操作简单，特异性强等优点，但由于酶本身的不稳定性，可能造成假阳性或假阴性结果。适配体电化学生物传感器是基于适配体的特异性作用，采用电化学的检测手段实现对目标物的定量分析的装置。与蛋白质相比，适配体具有更优越的特点：亲和力高，特异性强，稳定性好，易于修饰，生产成本低，靶分子范围广等。因此，利用适配体电化学生物传感器检测目标物，不仅具有耗时短，操作简单、特异性强、灵敏度高、可在线和易于微型化等优点，还避免了酶本身的影响，因此受到了人们高度重视。目前，利用适配体电化学生物传感器检测VerA尚未见报道。
技术实现思路
为了解决现有VerA检测技术单一，检测方案复杂，检测时间过长的缺点，本专利技术的第一个目的在于提供一种杂色曲菌素适配体，对于杂色曲菌素(VerA)具有高灵敏度、高选择性，可用于制备检测VerA的核酸适配体电化学传感器。本专利技术所述的杂色曲菌素适配体为含有核心序列AAGCCGCAC的13～21个碱基的单链DNA探针，即XnAAGCCGCACYm，其中，X和Y表示任意核酸碱基，n和m表示整数。根据本专利技术所述的杂色曲菌素适配体的进一步特征，所述适配体的5’端进行氨基修饰。优选地，所述5’端氨基修饰基团为-(CH2)6-NH2-。适配体5’端修饰的目的是为了引入固定端，本领域所熟知，不同的支撑基质直接固定适配体所采用的修饰方式是不同的，金电极多采用巯基修饰或生物素修饰，玻碳电极常采用5’氨基修饰，目前公开文献未见有在金电极上采用5’氨基修饰的方式进行适配体固定。本专利技术所述的适配体是采用5’端氨基的修饰方式，经实验表明，既可用于玻碳电极，也可用于目前公开文献未有报道的金电极。而且，本专利技术进一步确定了采用-(CH2)6-NH2-的氨基基团修饰的最佳方案。本专利技术的第二个目的在于提供一种检测杂色曲菌素适配体的核酸适配体电化学传感器，能实现对VerA的高灵敏度、高选择性的快速检测。本专利技术所述的检测杂色曲菌素适配体的核酸适配体电化学传感器，包括根据本专利技术所述的杂色曲菌素适配体。本专利技术进一步提供了所述的核酸适配体电化学传感器的制备方法。本专利技术所述的核酸适配体电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：i)金电极预处理：将金电极用氧化铝粉末水溶液打磨抛光处理后，用超纯水及无水乙醇超声清洗，去除电极表面的氧化铝粉末，将清洗好的金电极浸入新鲜配制的热的Piranha溶液(浓硫酸:30％H2O2＝7:3，V:V)中活化10min，即得到活化的金电极；ii)电极修饰：将活化后的金电极浸入到1umol·1-1适配体组装液中(含1mol·1-1NaCl)，4℃下密封组装22h，得到所述的适配体电化学生物传感器。本专利技术的第三个目的是提供了根据本专利技术所述的核酸适配体电化学生物传感器在检测VerA方面的应用。例如，本专利技术所述的适配体电化学生物传感器可用于检测真菌毒素等用途。本专利技术的第四个目的是提供了一种基于本专利技术所述的适配体传感器检测VerA的方法。本专利技术所述的基于本专利技术所述的适配体传感器检测VerA的方法，包括以下步骤：i)适配体传感器对VerA标准品的检测及其标准曲线的绘制：将所述的适配体电化学生物传感器用ddH2O冲洗，去除未结合的适配体，将所述适配体电化学生物传感器作为工作电极，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl(饱和KCl)电极作为参比电极，在5mmol·1-1的K3[Fe(CN)6]，含0.1mol·1-1KCl的电解液中进行微分脉冲伏安分析，记录适配体传感器的DPV图及其峰电流值Ip0。电化学参数：工作电位300mV-700mV，扫速为20mV/s，振幅为50mV，静息时间为2s；将所述适配体电化学生物传感器依次置于浓度为：0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100ng/ml的VerA标准溶液中，室温下反应15min，反应后用ddH2O冲洗去除非特异性吸附的VerA。在5mmol·1-1的K3[Fe(CN)6]，含0.1mol·1-1KCl的电解液中进行微分脉冲伏安(DPV)分析。电化学参数：工作电位300mV-700mV，扫速为20mV/s，振幅为50mV，静息时间为2s；记录各个VerA浓度下对应的DPV图谱及其峰电流值Ipn(n＝1,2…9)，计算各标准品相对初始的适配体传感器的峰电流变化值△Ip。以各VerA标准液浓度的对数为横坐标，以其对应的△Ip为纵坐标作图，建立标准曲线；ii)实际样品检测：玉米样品处理：取0.1g优质玉米粉，加入含4ml80％的甲醇溶液的EP管中，然后分别加入不同浓度的VerA标准品，振荡萃取45min，以5000r/min转速离心15min，上清用ddH2O稀释100倍后用于电化学检测；微分脉冲伏安法检测：根据权利要求5标准曲线绘制检测参数及检测方法，对分别含0.03ng/ml，0.3ng/ml，0.8ng/ml，50ng/ml的VerA玉米样品进行DPV分析，通过建立的标准曲线，计算出对应的VerA的浓度即为实际玉米样品中VerA的浓度。本专利技术所述的适配体电化学生物传感器是以本专利技术所述的适配体为分子识别元件来检测VerA的，其原理是：在VerA存在的情况下，本专利技术所述的适配体与VerA特异性结合，引起所述适配体空间构象发生变化，进一步影响电解液中铁氰化钾与电极界面的电子转移速率，即阻抗发生变化。通过建立VerA浓度的对数与ΔIp之间的线性关系，就可以达到检测VerA的作用。本专利技术的有益效果是：本专利技术基于适配体与VerA的特异性识别作用，采用DPV为电化学检测技术，建立了一种电化学适配体生物传感器检测VerA的方法，为VerA的检测提供了一种新的方法和途径。与目前的VerA检测方法相比较，本专利技术具有如下优点：(1)该传感器的制备是基于适配体与VerA的特异性识别作用所构建的，相比蛋白质而言，适配体具有亲和力高，特异性强，稳定性好，易于修饰，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种杂色曲菌素适配体，其特征在于，所述适配体为含有核心序列AAGCCGCAC的13～21个碱基的单链DNA探针，即XnAAGCCGCACYm，其中，X和Y表示任意核酸碱基，n和m表示整数。

【技术特征摘要】
1.一种杂色曲菌素适配体，其特征在于，所述适配体为序列如SEQIDNO：1-14任一所示的单链DNA探针。2.根据权利要求1所述的杂色曲菌素适配体，其特征在于：所述适配体的5’端进行氨基修饰。3.根据权利要求1所述的杂色曲菌素适配体，其特征在于：所述适配体的5’端具有氨基修饰基团-(CH2)6-NH2-。4.一种检测杂色曲菌素适配体的核酸适配体电化学传感器，其特征在于，所述的核酸适配体电化学传感器包括根据权利要求1至3之一所述的杂色曲菌素适配体。5.根据权利要求4所述的核酸适配体电化学传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：i）金电极预处理：将金电极用氧化铝粉末水溶液打磨抛光处理后，用超纯水及无水乙醇超声清洗，去除电极表面的氧化铝粉末，将清洗好的金电极浸入新鲜配制的热的Piranha溶液中活化10min，即得到活化的金电极，所述Piranha溶液中，浓硫酸与30%H2O2的体积比为7:3；ii）电极修饰：将活化后的金电极浸入到含有1umol·1-1如权利要求1-3之一所述的适配体的组装液中，4℃下密封组装22h，得到所述的适配体电化学生物传感器；所述适配体组装液含1mol·1-1NaCl。6.根据权利要求4所述的核酸适配体电化学生物传感器在检测VerA方面的应用。7.一种基于权利要求4所述的适配体传感器检测VerA的方法，其特征在于，包括以下步骤：i）适配体传感器对VerA标准品的检测及其标准曲线的绘制：将所述的适配体电化学生物传感器用ddH2O冲洗，去除未结合的适配体，将所述适配体电化学生物传感器作为工作电极，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘大岭，蒋海兰，姚冬生，谢春芳，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东;44