本发明专利技术建立并优化了南方红豆杉SSR-PCR反应体系。通过对南方红豆杉SSR-PCR反应体系的影响因素（引物、dNTP、Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA）在多个水平上进行优化试验，筛选出各反应因素的最佳水平，建立了南方红豆杉SSR-PCR 20μL最佳反应体系：引物2μM、dNTP 40μM、Taq DNA聚合酶1U、Mg2+1.0mM和模板DNA 75ng。该体系的建立能很好地满足南方红豆杉基因组DNA扩增要求，并为南方红豆杉的SSR分子标记及遗传多态性分析奠定了一定基础。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术建立并优化了南方红豆杉SSR-PCR反应体系。通过对南方红豆杉SSR-PCR反应体系的影响因素（引物、dNTP、Taq?DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA）在多个水平上进行优化试验，筛选出各反应因素的最佳水平，建立了南方红豆杉SSR-PCR?20μL最佳反应体系：引物2μM、dNTP?40μM、Taq?DNA聚合酶1U、Mg2+1.0mM和模板DNA?75ng。该体系的建立能很好地满足南方红豆杉基因组DNA扩增要求，并为南方红豆杉的SSR分子标记及遗传多态性分析奠定了一定基础。【专利说明】南方红豆杉SSR-PCR反应体系及其应用
本专利技术涉及分子生物学领域，具体地说，涉及南方红豆杉SSR-PCR反应体系及其 应用。
技术介绍
南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei )为裸子植物亚门（Cymmospermai ) 松杉纲（Coniferopside)红?杉目（Taxales)红?杉科（Taxaceae S. F. Gery)红?杉属 (Taxus Linn.)植物，是中国红豆杉属植物中分布最为广泛的一个种，自然分布于亚热带各 省区。红豆杉树皮中因含有抗癌药物成分紫杉醇导致其被大量砍伐或破坏，现已处于濒危 状态，在1999年我国国务院公布的《国家重点保护植物名录(第一批)》中被列为国家一级 保护植物。南方红豆杉材质优异，是高档珍贵用材，其紫杉醇含量虽稍低于喜马拉雅红豆杉 等，但因早期速生、生物收获量大，适宜短周期作业而具有巨大的药用开发利用价值。 SSR (简单重复序列，又称微卫星DNA，Simple Sequence Repeats或 Microsatellite DNAs)标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记 技术。与其它分子标记相比，以微卫星序列为基础的SSR标记在鉴定上显示了独特的优越 性：SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，揭示的多态性高；具有复等位基因的特性，提供的 信息量高；以孟德尔方式遗传，呈共显性；每个位点由设计的引物序列决定，便于不同实验 室相互交流合作开发引物，获得的资料能够在不同的实验室重复并共享；且操作简便、稳定 性、重复性好。已成为目前应用最广泛的第二代共显性分子遗传标记。 因此，建立一个稳定可靠、重复性好的南方红豆杉SSR-PCR反应体系，为进一步研 究南方红豆杉遗传多样性及地理变化、种源遗传分化等具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供优化的南方红豆杉SSR-PCR反应体系及其应用。 为了实现本专利技术目的，本专利技术的南方红豆杉SSR-PCR反应体系，所述反应体系总 体积20uL，其中，上、下游引物各2μΜ、dNTP 40yM、Taq DNA聚合酶lU、Mg2+1.0mM和模板 DNA 75ng，以 ddH20 配制。 其中，上游引物 F :5 ' -TGCGGAGTCATGTACAACTTAA-3 ';下游引物 R : 5 ^ -CCCTTGCTTTGTACCATATGTGA-3 ^。 PCR 扩增程序为：94°C 5min ;94°C 45s，56°C 45s，72°C 45s，35 个循环；60°C 30min〇 其中，模板DNA的提取包括以下步骤： (1)取-7(TC保存的南方红豆杉嫩叶0· 5?lg，放入经液氮预冷的研钵中，加入液 氮研磨成粉末； (2)将粉末快速转移到2mL离心管中，加入lmL 65°C预热的CTAB提取液，充分混 匀，65°C水浴30?45min。其间不时摇动离心管使之混匀； (3)取出离心管，4°C 12000rpm离心lOmin，取上清到新离心管中； (4)加入等体积的Tris平衡酚/氯仿/异戊醇（即Tris平衡酚、氯仿和异戊醇混 合液，其中，Tris平衡酚、氯仿和异戊醇的体积比为25 :24 :1)轻轻地颠倒混匀，放置lOmin， 4°C 12000rpm 离心 lOmin; (5)重复步骤（4); (6)吸上清到新离心管中，加入2-3倍体积的_20°C预冷无水乙醇和1/10体积醋 酸钠，混匀，_20°C放置30min以上，沉淀DNA ; (7)4°C 12000rpm离心10min，70%乙醇洗涤沉淀两次，自然风干，加入300-500yL 去离子水和2 μ L RNase溶解DNA，并于37°C水浴30min-lh ; (8)溶解后的DNA再用氯仿/异戊醇（即氯仿和异戊醇的混合液，二者体积比为24: 1)抽提一次； (9)沉淀用70%乙醇洗涤沉淀两次，然后自然风干后加入50 μ L去离子水； (10) 1%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度及完整性，_20°C保存。 本专利技术还提供所述SSR-PCR反应体系在南方红豆杉SSR分子标记及辅助育种中的 应用。 本专利技术建立并优化了南方红豆杉SSR-PCR反应体系。通过对南方红豆杉SSR-PCR 反应体系的影响因素（引物、dNTP、Taq DNA聚合酶、Mg2+、模板DNA)在多个水平上进行优化 试验，筛选出各反应因素的最佳水平，建立了南方红豆杉SSR-PCR 20 μ L最佳反应体系：弓丨 物2 μ M、dNTP 40 μ M、Taq DNA聚合酶lU、Mg2+l. OmM和模板DNA75ng。该体系的建立能很好 地满足南方红豆杉基因组DNA扩增要求，并为南方红豆杉的SSR分子标记及遗传多态性分 析奠定了一定基础。 通过建立一个稳定可靠、重复性好的南方红豆杉SSR-PCR反应体系，为进一步研 究南方红豆杉遗传多样性及地理变化、种源遗传分化等奠定基础，为开展植物分子辅助育 种、遗传转化及其转基因等方面的研究提供有价值的理论依据，从而为科学制定南方红豆 杉遗传保育策略及种质资源利用提供分子遗传学数据。 【专利附图】【附图说明】 图1为本专利技术提取样品的总DNA检测结果；其中，Μ为DL15000DNA Marker :从上 到下分别为 15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、2500bp、1000bp、250bp，1-93 泳道为样本。 图2为本专利技术引物浓度对SSR-PCR扩增结果的影响；其中，Μ为DNA Marker，1? 5 引物浓度分别为 1. 5、2. 0、2. 5、3. 0、3. 5μΜ。 图3为本专利技术dNTPs浓度对SSR-PCR扩增结果的影响；其中，Μ为DNA Marker，l? 5dNTPs 浓度分别为 10、20、30、40、50 μ Μ。 图4为本专利技术Taq DNA聚合酶浓度对SSR-PCR扩增结果；其中，Μ为DNA Marker， 1 ?5Taq DNA 聚合酶浓度分别为 0· 1、0· 25、0· 5、0· 75、L OU。 图5为本专利技术对SSR-PCR扩增结果的影响；其中，Μ为DNAMarker，1?5Mg2+浓度 分别为 〇· 5、1· 0、1· 5、2· 0、2· 5U。 图6为本专利技术模板DNA浓度对SSR-PCR扩增结果的影响；其中，Μ为DNA Marker， 1?5模板DNA浓度分别为65、70、75、80、85ng。 图7为本专利技术本文档来自技高网...
【技术保护点】
南方红豆杉SSR‑PCR反应体系，其特征在于，所述反应体系总体积20uL，其中，上、下游引物各2μM、dNTP 40μM、Taq DNA聚合酶1U、Mg2+1.0mM和模板DNA 75ng，以ddH2O配制；其中，上游引物F：5′‑TGCGGAGTCATGTACAACTTAA‑3′；下游引物R：5′‑CCCTTGCTTTGTACCATATGTGA‑3′。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：付伟，任鹤，朱振营，黄新，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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