一种与人源TLR2特异性结合的多肽，其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种与人源TLR2特异性结合的多肽，其制备方法和用途。具体而言，本发明专利技术的多肽其含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，或者含有该序列并在其他位置出现氨基酸替换，缺失或添加，且能与TLR2特异性结合。本发明专利技术提供了这种多肽序列的制备方法。本发明专利技术提供了这类多肽在制备预防和治疗TLR2相关疾病的药物中的应用。优选的TLR2相关疾病选自自身免疫病、慢性炎性疾病、肿瘤。优选的自身免疫病选自类风湿性关节炎；优选的慢性炎性疾病选自慢性阻塞性肺炎。本发明专利技术还提供了稳定表达TLR2的阳性细胞HEK293-TLR2/TLR1-luc，HEK293-TLR2/CD14-luc，HEK293-TLR2/TLR6-luc和本发明专利技术的多肽作为载体的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种与人源TLR2特异性结合的多肽，其制备方法和用途
本专利技术涉及一种能与人toll样受体2（TLR2）结合并且能激活其下游信号通路的多肽，其制备方法和制药用途，属于医药

技术介绍
Toll样受体2（TLR2）作为模式识别受体（patternrecognitionreceptor，PRR）中一类重要的受体，能特异地识别侵入体内的微生物病原相关模式分子(PAMPs)和体内的危险信号相关模式分子(PAMPs)，激活固有免疫应答，在免疫系统中起关键作用。TLR2主要识别微生物细胞壁的组成成分如细菌的脂肽，脂蛋白和磷壁酸等。研究发现在识别受体的过程中TLR2主要以与CD14、TLR1或TLR6等辅助性受体形成异源二聚体的形式；当特异性配基与细胞膜表面的TLR2结合后，主要通过MyD88信号依赖性通路将信号传至B诱导激酶(Binducingkinase，NIK)，NIK的活化导致B激活，B激活后即可启动细胞内炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-6等的合成释放。本实验室前期研究发现TLR2表达与肿瘤的发生发展密切相关，多种肿瘤细胞表面均能检测TLR2的表达，并且TLR2表达量的高低与肿瘤的恶性程度成正相关，例如乳腺癌细胞表面均能检测到TLR2表达，而转移能力高的乳腺癌细胞MDA-MB-231表面TLR2表达量是低转移能力乳腺癌细胞MCF7的十倍。同时TLR2也参与到其他疾病的发生发展，例如TLR2信号通路与类风湿性关节炎，I型糖尿病，炎性肠炎，慢性阻塞性肺炎，缺血再灌注损伤，动脉粥样硬化，红斑狼疮等多种自身免疫病和慢性炎症密切相关。激活TLR2信号通路，可以促进下游细胞因子TNFα、IL-6、TGFβ的释放，细胞因子参与以上疾病的进程。因此从新药研发的角度来看，TLR2可以作为许多疾病的表面标志分子，靶向TLR2进行药物研发具有很好的前景。噬菌体随机肽库技术是以以噬菌体展示技术（phagedisplay）为基础，通过基因工程手段将外源多肽与噬菌体的次要外壳蛋白pⅢ形成融合蛋白展示于噬菌体颗粒表面，可保持相对独立的空间构象和生物活性，而不影响重组噬菌体对宿主菌的感染能力。与其他基因表达系统相比较，噬菌体展示技术的最大特点就是它有效地将被展示多肽或蛋白质和基因偶联起来，构成一个实体，因而在得到某种多肽结构的同时也就获得了它的基因。噬菌体随机肽库技术是一项筛选并获得与靶抗原特异性结合肽的强有力、高通量的新技术，其筛选过程是一个亲和纯化（affinitypurification）的生物淘选(biopanning)过程，具体过程是：先将噬菌体肽库与靶分子相互作用一段时间，洗涤除去非特异结合噬菌体，将特异性结合噬菌体洗脱下来扩增，然后再投入下一轮的淘选。继续重复淘选、洗脱、扩增，最终淘选出与靶分子特异结合的重组噬菌体克隆。现有噬菌体展示技术通常是对纯化的蛋白进行筛选，得到与该靶蛋白特异性结合的寡肽或抗体，而对于细胞表面的受体而言，纯化的相应蛋白会在空间结构上发生改变，筛选出的寡肽或抗体在体内的结合效应降低，基于此本专利技术直接利用一对差异表达某种受体的细胞作为筛选的抗原，其中以不表达某种受体的细胞作为阴性细胞，通过阴性筛选去除肽库中与阴性细胞表面相结合的噬菌体，剩余的噬菌体再与表达相应受体的阳性细胞相结合，通过阳性筛选得到与受体相结合的噬菌体，此方法即为“体外快速差减筛选(BRASIL)”噬菌体随机肽库技术，最终获得与相应受体特异性结合的多肽。多肽D（klaklak）2是一段带正电并且具有α螺旋结构的14个氨基酸序列，能与膜电位较高的细菌等原核微生物细胞膜相结合，提高细菌细胞膜的通透性，造成细胞内基质外流，对细菌造成杀伤力；真核生物的细胞膜电位相比原核生物较低，多肽D（klaklak）2不能与其结合，因此降低了对真核生物的毒性；而在真核生物细胞内线粒体的膜结构与原核生物细胞膜相似，膜电位较高，因此D（klaklak）2可以与线粒体膜相结合，破坏线粒体膜结构，引起线粒体肿胀，造成细胞色素C的释放，进而引发下游caspase家族蛋白合成，使真核细胞进入线粒体途径的凋亡。研究报道将多肽D（klaklak）2其上游连接靶向肿瘤细胞的细胞穿膜肽，将其带入肿瘤细胞内，可引发肿瘤细胞进行线粒体途径的凋亡，因此此肽段具有较高的新药开发价值。本专利技术中使用的阴性细胞为细胞膜表面不表达TLR2受体的HEK293细胞系，阳性细胞为本实验室构建的稳定表达TLR2及其辅助性受体CD14、TLR1或TLR6的HEK293细胞系。同时又将TLR2信号通路的报告基因，即B荧光素酶报告基因也稳定表达到以上阴性和阳性细胞系中，作为验证所筛选出的多肽是否具有激活TLR2信号通路功能的细胞平台。
技术实现思路
本专利技术的一个实施方案提供了一种多肽，其含有SEQIDNO：1所示的氨基酸序列。His-Leu-Tyr-Val-Ser-Pro-Trp。本专利技术的一个实施方案提供了一种多肽，含有SEQIDNO：1所述氨基酸序列并在其他位置出现氨基酸替换，缺失或添加，且能与TLR2特异性结合。本专利技术的一个实施方案提供了上述的多肽的制备方法，包括如下步骤：4.1经过对阴性细胞和阳性细胞进行有机溶剂法差异筛选，获得能与阳性细胞选择性结合的重组噬菌体；4.2噬菌体对阴性细胞，阳性细胞以及重组蛋白TLR2结合能力的测定；4.3单克隆噬菌体的分离制备；4.4噬菌体基因组单链DNA的提取和获得寡肽序列；4.5固相多肽合成仪合成获得寡肽序列；4.6荧光标记的寡肽序列对多种表达TLR2的细胞进行流式细胞术和免疫荧光法测定。优选的阴性细胞选自不表达TLR2的HEK293细胞，优选的阳性细胞选自稳定表达TLR2的HEK293细胞。所述的有机溶剂法差异筛选优选是经过四轮。本专利技术的一个实施方案提供了上述多肽在制备预防和治疗TLR2相关疾病的药物中的应用。本专利技术的多肽能和TLR2特异性的结合，由于TLR2信号通路参与许多自身免疫病（例如类风湿性关节炎）及慢性炎症疾病（例如慢性阻塞性肺炎）的发生及发展，激活TLR2信号通路，促进相关细胞因子释放可以抑制以上疾病的进程，该多肽生物学功能在于激活TLR2信号通路和促进相关细胞因子释放，因此其适应症在于治疗以上自身免疫病及慢性炎症疾病。所述的预防和治疗TLR2相关疾病是通过激活TLR2信号通路，促进下游细胞因子的释放实现的。优选的TLR2相关疾病选自自身免疫病、慢性炎性疾病、肿瘤。优选的自身免疫病选自类风湿性关节炎；所述的慢性炎性疾病选自慢性阻塞性肺炎。本专利技术的一个实施方案提供了稳定表达TLR2的阳性细胞HEK293-TLR2/TLR1-luc，HEK293-TLR2/CD14-luc，HEK293-TLR2/TLR6-luc。本专利技术的一个实施方案提供了本专利技术的多肽作为载体的应用。本专利技术的一个实施方案提供了一种物质，这种物质含有本专利技术的多肽和其他偶联物。本专利技术的多肽作为载体，能将其他偶联物带入表达TLR2的细胞。优选的其他偶联物可以是各种治疗剂，例如选自促进凋亡的多肽。本专利技术的多肽和促进凋亡的多肽偶联后能制备预防和治疗肿瘤，尤其是通过靶向TLR2治疗肿瘤。本专利技术的一个实施方案提供了一种试剂盒，含有权利要求1-2中任一项的多肽。本专利技术的肽段可以偶联于检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多肽，其特征在于，其含有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种多肽，其特征在于，其由SEQIDNO：1所示的氨基酸序列构成。2.权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，由如下步骤制成：a)经过对阴性细胞和阳性细胞进行有机溶剂法差异筛选，获得能与阳性细胞选择性结合的重组噬菌体；b)噬菌体对阴性细胞，阳性细胞以及重组蛋白TLR2结合能力的测定；c)单克隆噬菌体的分离制备；d)噬菌体基因组单链DNA的提取和获得寡肽序列；e)固相多肽合成仪合成获得寡肽序列；f)荧光标记的寡肽序列对多种表达TLR2的细胞进行流式细胞术和免疫荧光法测定；所述的阴...

【专利技术属性】
技术研发人员：李珂，吕晓希，胡卓伟，
申请(专利权)人：中国医学科学院药物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11